Dérivation de cellules souches de la souris Trophoblast à partir de blastocystes

Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons l'isolement des blastocystes de souris et de la dérivation de cellules souches trophoblastiques à partir de blastocystes. Nous décrivons également les conditions d'entretien de la propriété de cellules souches ainsi que l'induction de la différenciation en culture.

Abstract

Spécification du trophectoderme est l'un des événements les plus anciens de différenciation du développement des mammifères. La lignée dérivée de trophoblaste trophectoderme médie l'implantation et génère la partie foetale du placenta. En conséquence, le développement de cette lignée est essentielle pour la survie des embryons. Dérivation de la tige du trophoblaste (TS), les cellules à partir de blastocystes de souris a été décrite par Tanaka<em> Et al.</em> 1998. La capacité des cellules TS afin de préserver la propriété trophoblaste spécifiques et leur expression de la scène et du type de cellules de marqueurs spécifiques après stimulation adéquate fournit un système modèle intéressant d'étudier le développement lignée trophoblaste lequel récapitulant les événements placentation tôt. Par ailleurs, les cellules trophoblastiques sont l'un des rares types de cellules somatiques en cours d'amplification du génome naturel. Bien que les voies moléculaires qui sous-tendent polyploïdisation du trophoblaste ont commencé à se dénouer, le rôle physiologique et l'avantage de l'amplification du génome du trophoblaste reste largement insaisissable. Le développement des cellules souches diploïdes dans les cellules trophoblastiques polyploïdes dans la culture fait de ce<em> Ex vivo</emSystème> un excellent outil pour élucider le mécanisme de régulation de la réplication du génome et de l'instabilité dans la santé et la maladie. Nous décrivons ici un protocole basé sur les rapports antérieurs à la modification publiée dans Chiu<em> Et al.</em> 2008.

Protocol

Dans ce protocole, nous décrivons la préparation de blastocystes de souris et de la création de lignées de cellules TS. Manipulations de souris générale préalable à la collecte de blastocystes, y compris la mise en place pour l'accouplement naturel et l'induction de l'ovulation super, essentiellement suivi le protocole standard illustré par Nagy et al. 2003 (pp146-150). Dérivation et la maintenance des cellules TS Croisées entre les souris d'él…

Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons le processus de collecte E3.5 blastocystes à partir des procédures de l'utérus et d'expérimentation pour établir des lignées de cellules TS. Nous décrivons également la condition de maintenir le caractère souche de cellules TS et d'induire leur différenciation en cellules différenciées. Deux étapes essentielles pures pour obtenir des lignées de cellules TS sont le moment de la désagrégation prolongement (étape 9) et le traitement du premier passage (étape…

Materials

Reagents

TS medium:
RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercaptoethanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C:
Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM):
Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 10⁶/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA:
Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x):
Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x):
Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).