胚盤胞からマウス栄養膜幹細胞の導出
Summary
このビデオでは、我々はマウス胚盤胞と胚盤胞から栄養膜幹細胞の派生の分離を示しています。我々はまた、幹細胞のプロパティのメンテナンスだけでなく、文化の分化誘導のための条件について説明します。
Abstract
栄養外胚葉の仕様は、哺乳類の発生の最も初期の分化のイベントの一つです。栄養外胚葉を仲介移植から派生し、絨毛の系統は、胎盤の胎児の一部を生成します。その結果、この系統の開発は、胚の生存に必須です。マウスの胚盤胞から栄養膜幹細胞（TS細胞）の導出は、最初に田中によって記述されていた<em>ら。</em> 1998。適切な刺激の後のステージと細胞タイプ特異的マーカーのトロホブラスト特定のプロパティとそれらの発現を維持するためにTS細胞の能力は、初期の胎盤形成のイベントをrecapitulatingにより栄養膜の系統の開発を調査する貴重なモデルシステムを提供します。さらに、栄養膜細胞は、天然のゲノム増幅を受けているいくつかの体細胞のタイプのいずれかです。栄養膜polyploidizationの根底にある分子経路が解明し始めているものの、栄養膜のゲノム増幅の生理的役割と利点は、主にとらえどころのないままです。文化における倍数体栄養膜細胞への二倍体性幹細胞の開発は、このしています<em>生体外で</em>システムの健康と疾患におけるゲノム複製と不安定性の調節機構を解明するための優れたツール。ここでは、チウに発表された変更と、以前の報告に基づいてプロトコルを記述する<em>ら。</em> 2008。
Protocol
Discussion
このビデオでは、我々は、TS細胞株を確立するために子宮や実験手順からE3.5胚盤胞を収集するプロセスを示しています。我々はまた、TS細胞のstemnessを維持し、分化した細胞への分化を誘導する条件について説明します。純粋なTS細胞株を取得する2つの重要なステップは、伸長の分解のためのタイミング（手順9）と初通過（ステップ11）処理です。それは、大規模な胚盤胞は、手順9または手?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、元のプロトコルのためにジャネットRossantに感謝。本研究では、WHの保健助成金CA106308の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
Reagents
TS medium:
RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercaptoethanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.
Mitomycin C:
Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.
Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM):
Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.
PBS/BSA:
Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.
FGF4 (1000x):
Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).
Heparin (1000x):
Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).
References
- Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hsu, W. SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages. PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).
- Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts. Development. 132, 1649-1661 (2005).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual. , (2003).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
