Summary
Dette arbejde præsenterer et alternativt flatmount retina-præparat, hvor fjernelse af fotoreceptorcellelegemer muliggør hurtigere antistofdiffusion og forbedret patchpipetteadgang til indre retinale neuroner til immunhistokemi, in situ-hybridisering og elektrofysiologiske eksperimenter.
Abstract
Bipolære celler og vandrette celler i hvirveldyrets nethinden er de første neuroner, der behandler visuel information, efter at fotoner er detekteret af fotoreceptorer. De udfører grundlæggende operationer som lystilpasning, kontrastfølsomhed og rumlig og farvemodsætning. En fuldstændig forståelse af de præcise kredsløb og biokemiske mekanismer, der styrer deres adfærd, vil fremme visuel neurovidenskabelig forskning og oftalmologisk medicin. Imidlertid er de nuværende præparater til undersøgelse af bipolære og vandrette celler (retinale hele monteringer og lodrette skiver) begrænset i deres evne til at fange disse cellers anatomi og fysiologi. I dette arbejde præsenterer vi en metode til fjernelse af fotoreceptorcellelegemer fra levende, flatmount musenethinder, hvilket giver forbedret adgang til bipolære og vandrette celler for effektiv patch clamping og hurtig immunmærkning. Opdelte nethinden fremstilles ved at sandwiche en isoleret musenethinden mellem to stykker nitrocellulose og derefter forsigtigt skrælle dem fra hinanden. Adskillelsen deler nethinden lige over det ydre plexiforme lag for at give to stykker nitrocellulose, en indeholdende fotoreceptorcellelegemerne og en anden indeholdende den resterende indre nethinden. I modsætning til lodrette nethindeskiver afbryder det delte nethindepræparat ikke de dendritiske processer i indre retinale neuroner, hvilket giver mulighed for optagelser fra bipolære og vandrette celler, der integrerer bidragene fra gap junction-koblede netværk og wide-field amakrin celler. Dette arbejde demonstrerer alsidigheden af dette præparat til undersøgelse af vandrette og bipolære celler i elektrofysiologi, immunohistokemi og in situ hybridiseringseksperimenter.
Introduction
Nethinden er et tyndt neuralt væv placeret i det bageste øje, hvor lys opfanges og behandles til et elektrokemisk signal, der kan fortolkes af hjernen. På bagsiden af nethinden stimuleres stang- og keglefotoreceptorer af lys, hvilket reducerer den toniske frigivelseshastighed for neurotransmitteren, glutamat1. De første neuroner, der oplever og reagerer på denne lysinducerede ændring i glutamatkoncentrationen, er de bipolære celler (BC'er) og vandrette celler (HC'er), hvis somas befinder sig i den yderste region af det indre nukleare lag (INL). Disse andenordens neuroner udfører den første fase af signalbehandling i nethinden og former kritiske træk ved synet, såsom lystilpasning, kontrastfølsomhed og rumlig / farvemodstand2. Mens disse funktioner er blevet tilskrevet BC'er og HC'er, er kredsløbene og de biokemiske mekanismer, der ligger til grund for disse processer, ikke fuldt ud forstået3. Derfor er udviklingen af værktøjer og metoder til at udforske BC og HC fysiologi af afgørende betydning.
Lodrette (tværgående) nethindesektioner har længe vist sig at være den mest praktiske model til at studere BC'er og HC'er; visse aspekter af BC- og HC-fysiologi er imidlertid utilgængelige for eksperimentatoren under denne model. Direkte optagelser fra HC'er eller indirekte målinger af deres virkninger på BC'er afspejler ikke nethindens endogene forbindelse, da disse cellers laterale processer afbrydes under udskæring. Hele monterede nethindepræparater omgår dette problem ved at bevare disse laterale processer, men de omgivende retinale lag udgør en udfordring for at få adgang til disse celler4. Mens der er rigelige eksempler på immunfarvning 5,6,7,8 og patch clamp optagelser9 fra INL neuroner i hele mount nethinder, er der mulighed for at fremskynde og forenkle indsamlingen af disse data. De iboende begrænsninger ved tværgående sektioner og udfordringerne ved hele monteringsmodellen inspirerede således udviklingen af dette alternative flatmount nethindepræparat.
Følgende arbejde beskriver en protokol til let fjernelse af fotoreceptorlaget fra levende, fladmonterede nethinden for at forbedre adgangen til BC'er og HC'er for forenklet patchfastspænding og hurtigere og mere effektiv immunmærkning. Skrælning fra hinanden to stykker nitrocellulosemembran fastgjort til hver side af en isoleret nethinden river vævet gennem fotoreceptoraxonerne og efterlader en delt nethinden, der bevarer det ydre plexiformlag (OPL) og alle indre retinale lag. Mens andre har beskrevet protokoller til mekanisk adskillelse af lag af nethinden, er disse metoder enten dårligt egnede til patch clamping og mikroskopi applikationer eller kræver kedelig manipulation af vævet. Flere af disse metoder kræver frosset eller frysetørret væv til lagadskillelse, hvilket gør dem uforenelige med elektrofysiologiske eksperimenter10,11,12. Andre er designet til levende væv, men kræver 5-15 sekventielle peelinger med filterpapir 4,11 eller behandling med trypsin 13 for at fjerne fotoreceptorerne. Den teknik, der beskrives her, forbedrer sine forgængere ved at forenkle proceduren for fjernelse af fotoreceptorer og udvide repertoiret af downstream-applikationer.
Protocol
Mus blev forsynet med vand og mad ad libitum og blev opretholdt på en 12 timers lys / mørk cyklus. Mus blev aflivet ved eksponering for isofluran efterfulgt af cervikal dislokation. Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer og godkendt af Oregon Health and Science University Institutional Animal Care and Use Committee.
BEMÆRK: Øjenenukleation, retinadissektion og nethindeopdeling skal udføres så hurtigt som muligt for at bevare det levende vævs sundhed. Målet er at fuldføre dissektionen på < 4 minutter pr. øje. Disse tre trin skal udføres sekventielt. Vildtypemus: Voksne (>3 måneder) mandlige og kvindelige C57BL/6J-mus blev brugt til forsøg. Til synapsemorfologi blev mus, der udtrykte grønt fluorescerende protein (GFP) under Pcp2-promotoren (Pcp2-cre/GFP)14 , anvendt. Transgene mus: Til horisontal cellevisualisering med GFP under immunohistokemi eller elektrofysiologiske eksperimenter blev der anvendt en tredobbelt transgen mus: vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d. vGATFlpo- og vGluT2Cre-stammerne er knock-in-mus, der udtrykker Flpo- eller Cre-rekombinase, nedstrøms for deres respektive promotorer. Ai80d-musen er en intersektionel reportermus (CatCh/EYFP) og vil kun udtrykke Ca2+ permeabel kanal rhodopsin (ChR2) i celler, der udtrykker Cre- og Flpo-rekombinasier. Således udtrykker den tredobbelte transgene mus kun ChR2 i celler med en historie med både VGAT- og vGluT2-ekspression.
1. Materialeforberedelse til retinadissektion og retina-opdeling
- Forbered stykker nitrocellulosemembran
BEMÆRK: Afmontering af den delte nethinden fra nitrocellulosemembranen reducerer baggrundsfluorescens i mikroskopi og forenkler optagelse af patchklemmer. Membranfjernelse kan udføres før eller efter vævsfiksering. For faste splittede nethinden er det ikke nødvendigt at behandle stykkerne af nitrocellulosemembran. For levende splittede nethinder, behandle membranen i henhold til trin 1.1.3 - 1.1.5 for at lette blid løsrivelse fra vævet.- Skær 16 stykker (eller mere) nitrocellulosemembran i firkanter på 5 mm x 5 mm. Ekstra kan klargøres i løs vægt og opbevares til fremtidig brug.
- Sæt halvdelen af membranstykkerne til side til senere brug. Disse stykker behandles ikke med en blokerende opløsning.
- De resterende stykker inkuberes i en rengøringsmiddelfri IHC-blokerende opløsning (såsom 3% hesteserum + 0,025%NaN3 fortyndet i PBS) i 10 minutter ved stuetemperatur, omrystes forsigtigt.
FORSIGTIG: Brug passende PPE ved håndtering af NaN3, da det er et potent toksin. - Membranstykkerne vaskes grundigt ved inkubation i bicarbonatbufferede Ames-medier i 10 minutter ved stuetemperatur, omrystes forsigtigt.
- Lufttør de blokerede membranstykker helt (~20 min). Mærk og opbevar membranstykkerne ved stuetemperatur, og hold dem adskilt fra de ubehandlede membranstykker.
- Forbered Ames medier
- Forbered bicarbonatbufferede Ames-medier, og opbevar opløsningen ved stuetemperatur under konstant carbogenation (95%O2 og 5% CO2).
2. Museøje enukleation
- Aflive musen ved hjælp af enhver tilgængelig metode i henhold til institutionelle IACUC-retningslinjer.
- Vend musen på den ene side, og brug to fingre til forsigtigt at trykke ned omkring øjenhulen. Dette vil få øjet til at bule ud fra kraniet.
- Brug buet dissektionssaks til at klippe under det bulede øje for at adskille synsnerven og adskille øjet fra kraniet.
- Øs øjet med en saks og læg det i en petriskål fyldt med iskolde Ames-medier.
BEMÆRK: Til downstream-applikationer, hvor vævet fikseres efter opdeling, kan iskold PBS bruges i stedet for Ames-medier. - Gentag trin 2.1 - 2.4 for det resterende øje.
3. Nethindedissektion
- Brug den brugerdefinerede glasoverførselspipette til at overføre det ene øje til en ny petriskål, der indeholder friske, iskolde Ames-medier.
BEMÆRK: Den brede åbning af den brugerdefinerede overførselspipette forhindrer utilsigtet klemning af vævet, og brug af glas minimerer vedhæftning af vævet til pipettens vægge. En plastoverførselspipette med bred mund er dog også acceptabel, hvis eksperimentatoren allerede er dygtig til at bruge dette værktøj. - Brug tang til at stabilisere øjet ved at fastgøre dets ekstra bindevæv til bunden af petriskålen. Punktere derefter øjet langs ora serrata-linjen ved hjælp af en 25G-nål for at skabe et indgangspunkt for Vannas-saksen.
- Brug Vannas-saksen til at klippe langs ora serrata-linjen, indtil hornhinden kommer fri fra resten af øjet (supplerende figur 1A). Fjern linsen fra øjekoppen med pincet (supplerende figur 1B).
- Brug den brugerdefinerede glaspipette til at overføre øjenkoppen til et stort volumen (≥100 ml) karbogeneret Ames, og gentag trin 3.1 - 3.3 med det resterende øje.
BEMÆRK: Øjenkopper placeres i carbogenated Ames for at opretholde vævets sundhed, mens dissektionen udføres på det andet øje. - Overfør den ene øjenkop til en petriskål fyldt med friskcarbogenerede Ames.
- Brug Vannas-saks til at lave en lille snip indad fra kanten af scleraen, og brug derefter to par tang til at skrælle sclera væk fra nethinden (supplerende figur 1C). Undgå at gribe fat i nethinden med tangen. Træk i stedet klapperne på scleraen, der er oprettet af sakseklippen, fra hinanden.
- Brug Vannas-saksen til at klippe synsnerven, der forbinder sclera og nethinden (supplerende figur 1D), og lirk derefter forsigtigt nethinden fra sclera ved hjælp af saksen eller tangen for at isolere nethinden. (Figur 1A).
BEMÆRK: Mens RPE typisk forbliver fastgjort til øjenkoppen, kræves der ingen ekstra trin for at fjerne RPE, hvis den er fastgjort til nethinden. På dette tidspunkt kan kanterne af nethinden eventuelt trimmes med en skalpel for at forhindre krølle under fladningstrinnet (figur 1B). - Brug en skalpel til at skære nethinden i halve eller kvarte (figur 1C), og brug derefter den brugerdefinerede overførselspipette til at returnere stykkerne til et stort volumen (≥ 100 ml) kontinuerligt karbogenerede Ames-medier.
BEMÆRK: Valget af halvdele eller kvartaler er subjektivt. Vælg den bedste mulighed for den ønskede applikation. - Gentag trin 3.5 - 3.8 for det resterende øje, før du fortsætter til retina-opdeling.
4. Retina opdeling
- Kassér Ames-mediet fra petriskålene og erstat det med friskkarbogenerede Ames.
BEMÆRK: For at opretholde carbogenation under resten af retina-opdelingsproceduren skal du udskifte mediet i petriskålen med friskkarbogenerede Ames ca. hvert 5. minut. - Brug den brugerdefinerede overførselspipette til at placere et stykke nethinden på et glasglas (7,5 cm x 5 cm), ganglioncellesiden opad, og flad det derefter ud ved at fjerne den omgivende væske med en delikat opgaveserviet (figur 1D). Træk om nødvendigt forsigtigt retinale kanter med en fin spids pensel under et dissektionsmikroskop.
- Brug tang til at sænke et tørt 5 mm x 5 mm stykke nitrocellulosemembran ned på nethinden, hvilket får det til at klæbe til ganglioncellesiden (figur 1E).
BEMÆRK: Hvis membranfjernelse fra levende væv er påkrævet (dvs. til elektrofysiologi), skal du bruge et tørt stykke serumbehandlet membran til dette trin (se trin 1.1.3 - 1.1.5 for detaljer). Dette reducerer styrken af vedhæftningen til ganglioncellelaget, hvilket gør det lettere at fjerne nethinden fra nitrocellulosen efter split. - Vend nethinden om, så nitrocellulosen hviler på glasglasset, og læg et tørt stykke 5 mm x 5 mm membran på fotoreceptorsiden af nethinden (figur 1F).
- Berør den fugtede spids af penslen mod mellemrummet mellem de to membraner, og lad kapillærvirkningen suge Ames ind i sandwichen (figur 1G). Dette reducerer membranernes vedhæftning til nethinden og er kun nødvendig, hvis nethinden er blevet overdrevent tørret med den sarte opgavetørring.
BEMÆRK: Hvis nethinden har mistet sit skinnende udseende, er den blevet overdrevent tørret, og trin 4.5 er nødvendigt. - For at sikre ensartet vedhæftning påføres let nedadgående tryk på den øvre membran med en våd pensel (figur 1H).
- Mens du fastgør den nederste membran til glasset med et par tang, skal du bruge en langsom, stabil bevægelse til forsigtigt at skrælle den øverste membran væk med et andet par tang. Dette vil få nethinden til at splitte lige over OPL (figur 1I).
- Kassér den øvre membran, der indeholder fotoreceptorerne (figur 1J, venstre). Den nedre membran indeholder den indre nethinde, fremover benævnt en delt nethinde (figur 1J, højre).
- Returner straks den delte nethinde til carbogenated Ames media.
BEMÆRK: For eksperimenter på levende væv kan nethinden drage fordel af en 15-30 minutters restitutionsperiode i carbogenated Ames efter opdeling.
Figur 1: Split retina procedure . (A) Efter enukleation og øjenkopforberedelse i kolde PBS- eller Ames-medier isoleres musens nethinde fra øjenkoppen, og PBS erstattes med karbogenerede Ames-medier ved stuetemperatur. (B) Brug en skalpel til at trimme kanterne af nethinden væk, indtil der ikke er nogen regioner med en indadgående krølle (valgfrit). (C) Skær nethinden i kvarte eller halve ved hjælp af en skalpel. (D) Anbring et stykke nethinden på et glasglas (ganglioncellesiden opad) ved hjælp af den brugerdefinerede overførselspipette og fjern alt overskydende Ames ved hjælp af en delikat opgaveserviet. Sørg for, at den halvtørre nethinden ligger fladt på glasset, før du fortsætter til næste trin. Brug en Ames-fugtet penselspids til forsigtigt at udfolde områder af nethinden, der ikke er flade. (E) Brug pincet til at placere et forskåret stykke tør nitrocellulosemembran (5 mm x 5 mm) på den flade nethinde. (F) Vend nitrocellulosestykket, så fotoreceptorsiden af nethinden nu vender opad. Placer derefter et andet tørt stykke membran på nethinden. (G) Rør den våde spids af børsten mod mellemrummet mellem de to membraner, og lad kapillærvirkningen suge Ames ind i sandwichen. Dette reducerer membranernes vedhæftning til nethinden og er kun nødvendig, hvis nethinden blev overdrevent tørret med den sarte opgavetørring. (H) Brug en våd penselspids til forsigtigt at trykke nedad på midten af den klemte nethinde. (I) Brug et par tang til at fastgøre det nederste stykke membran på glasglasset, mens du bruger et andet par tang til forsigtigt at skrælle det øverste stykke membran væk fra det nederste. (J) Den indre nethinde (venstre) forbliver på bundmembranen, mens fotoreceptorerne (højre) trækkes væk med den øverste membran. Panelerne (A), (B), (C), (D) og (J) blev erhvervet ved hjælp af et dissektionsmikroskop; skalabjælken repræsenterer ca. 1 mm; paneler (E-I) blev erhvervet med et smartphone-kamera uden forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Forberedelse af splittede nethinden til immunofluorescensforsøg
BEMÆRK: Den delte nethinden vil stadig være fastgjort til nitrocellulosemembranen indtil trin 5.5. Udfør enten trin 5.1, 5.2, 5.3 eller 5.4, ikke alle fire, da disse er til forskellige eksperimenter.
FORSIGTIG: Brug passende PPE og fortsæt forsigtigt, når du håndterer paraformaldehyd (fikseringsmiddel).
- Forberedelse til flatmount immunofluorescens
- Inkuber den delte nethinden i 4% paraformaldehyd på is i 30 minutter ved hjælp af tilstrækkelig opløsning til helt at dække nethinden.
- Vask de delte nethinden 3x i 5-10 ml stuetemperatur PBS. Valgfri pause: Opdelte nethinder kan efterlades i PBS ved 4 °C i op til 24 timer.
- Forberedelse til immunfluorescens med lodrette sektioner af delt nethinden
- Inkuber den delte nethinden i 4% paraformaldehyd på is i 30 minutter ved hjælp af tilstrækkelig opløsning til helt at dække nethinden.
- Vask de delte nethinden 3x i 5-10 ml stuetemperatur PBS. Valgfri pause: Opdelte nethinder kan efterlades i PBS ved 4 °C i op til 24 timer.
- Mens membranen stadig er fastgjort, nedsænkes den delte nethinde sekventielt i 10%, 20% og 30% saccharose ved 4 °C i hver 1 time for at kryobeskytte vævet.
- Integrer de kryobeskyttede splitnethinden i optimal skæretemperatur (O.C.T.) og opbevar dem ved -80 °C (op til 6 måneder) indtil kryosektion.
- Fjern de indlejrede splittede nethinden fra -80 °C, og brug en kryostat til at skære sektioner, der er 20 μm tykke. Monter sektionerne på elektrostatisk ladede glasmikroskopglas, lad dem lufttørre, og opbevar dem derefter ved -20 °C i op til 6 måneder.
- Forberedelse til dobbelt fluorescens in situ hybridisering og immunhistokemi
- Inkuber den delte nethinden i 4% paraformaldehyd på is i 2 timer ved hjælp af tilstrækkelig opløsning til helt at dække nethinden.
- Vask de delte nethinden 3x i 5-10 ml stuetemperatur PBS. Valgfri pause: Opdelte nethinder kan efterlades i PBS ved 4 °C i op til 24 timer.
- Forberedelse til elektrofysiologi
- Klargør plasterpipetter ved at trække tykvæggede borosilikatglaspipetter med glødetråd ved hjælp af en mikropipetteaftrækker. Brug kun pipetter med en målt modstand mellem 6-10 MΩ.
- Fyld de udtrukne pipetter tilbage med intern opløsning indeholdende (i mM): 125 K-gluconat, 8 KCl, 5 HEPES, 1 MgCl2, 1CaCl2, 0,2 EGTA, 3 ATP-Mg og 0,5 GTP-Na.
- Fjernelse af den delte nethinden fra nitrocellulosemembranen
- Brug en hydrofob barrierepen til at forberede cirkulære brønde på et mikroskopglas (~ 1 cm i diameter) og lad dem lufttørre i 5-10 minutter.
- Placer de delte nethinden i de forberedte hydrofobe barrierepenbrønde og tilsæt nok PBS til helt at dække dem.
- Under et dissektionsmikroskop skubbes børsterne på en fin pensel under vævets kanter og løftes forsigtigt opad. På denne måde skal du arbejde rundt om nethinden i en cirkel for at løfte den væk fra membranen.
- Brug tang til at fjerne membranen fra under det flydende stykke nethinden.
- Suspirer forsigtigt væk den resterende PBS, så nethinden kommer til at hvile på mikroskopet dias, ganglion celle-side nedad.
BEMÆRK: Følgende trin skal ikke udføres sekventielt. Vælg den passende protokol til den ønskede applikation (dvs. immunfarvning eller dobbelt fluorescens in situ hybridisering [FISH] og immunhistokemi [IHC] eller elektrofysiologi).
6. Immunfarvning
- Hvis du endnu ikke er klargjort, skal du bruge en hydrofob barrierepen til at skabe cirkulære brønde på et mikroskopglas (~ 1 cm i diameter) og lade dem lufttørre i 5-10 minutter. Alle inkubationstrin og vasketrin udføres i disse pennehuller.
- Inkuber de delte nethinden eller lodrette delte nethindesektioner i antistofinkubationsopløsning (AIS: 3% hesteserum, 0,5% Triton X-100, 0,025% NaN3 i PBS) i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber de delte nethinden eller lodrette split retina sektioner med primære antistoffer fortyndet i AIS i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Primær antistofinkubationstid vil kræve optimering for forskellige proteinmål og antistoffer. - Væv vaskes 3x i stuetemperatur PBS.
- Inkuber vævet med sekundære antistoffer fortyndet i AIS i 1 time ved stuetemperatur. Væv vaskes 3x i stuetemperatur PBS.
- Hvis der ønskes nuklear farvning, inkuberes vævet med DAPI fortyndet i PBS i 30 s ved stuetemperatur. Vask vævet 1x i stuetemperatur PBS.
- Påfør en dråbe glidemonteringsmedier på hvert stykke serviet, og monter et glasdæksel.
- Påfør neglelak rundt om kanterne af dæksel for at forsegle prøven. Opbevar objektglasset ved 4 °C.
7. Dobbelt fisk og IHC
- Bag de delte nethinder ved 40 °C i 30 minutter i en hybridiseringsovn for at øge vedhæftningen til diaset.
- Udfyld RNAscope FISH-protokollen i henhold til producentens protokol med følgende undtagelser og ændringer:
- Der kræves ikke noget antigenhentningstrin. Brug protease III med en inkubationstid på 18 min ved stuetemperatur.
- Udfør alle vasketrin på objektglasset i hullerne lavet af en hydrofob barrierepen.
- Prøverne inkuberes i primært fortyndet antistof (se materialetabellen) i PBS i 30 minutter ved 40 °C i hybridiseringsovnen. Prøverne vaskes 3x i PBS ved stuetemperatur.
- Prøverne inkuberes i sekundært fortyndet antistof (se materialetabel) i PBS i 30 minutter ved 40 °C i hybridiseringsovnen. Prøverne vaskes 3x i PBS ved stuetemperatur.
- Inkuber prøverne i 1x DAPI i 30 s ved stuetemperatur. Prøverne vaskes 1x i PBS ved stuetemperatur.
- Påfør en dråbe anti-fade monteringsmedier på hvert stykke væv og monter et glasdæksel.
- Påfør neglelak rundt om kanterne af dæksel for at forsegle prøven. Opbevar objektglasset ved 4 °C.
8. Elektrofysiologi
- Efter fjernelse af nitrocellulosemembranen overføres en delt nethinden til patch-clamp-optagekammeret og forankres den forsigtigt på plads med en platinharpe.
- Under hele eksperimentet perfuseres den delte nethinden kontinuerligt med Ames-opløsning karbogeneret med 95%O2 og 5% CO2. Opbevar opløsningen mellem 32-34 °C.
BEMÆRK: Under eksperimentet kan vævet visualiseres ved hjælp af Dodt gradient kontrastmikroskopi. - Under rumbelysning skal du udføre spænding i hele cellen for at optage fra INL-neuroner.
- Under optagelse skal du simulere lysresponser ved hjælp af en mikrocellulær injektionsenhed til påføring af farmaceutiske forbindelser eller en 470 nm LED til stimulering af kanalrhodopsin (ChR2).
BEMÆRK: Lysintensiteten kan måles ved hjælp af en digital optisk effektmåler.
- Under optagelse skal du simulere lysresponser ved hjælp af en mikrocellulær injektionsenhed til påføring af farmaceutiske forbindelser eller en 470 nm LED til stimulering af kanalrhodopsin (ChR2).
9. Konfokal mikroskopi
- For konfokal immunfluorescens skal du tage billeder med et konfokalmikroskop ved hjælp af et 40x / 1,3 eller 63x / 1,40 olienedsænkningsmål. Brug FIJI til at justere lysstyrke og kontrast og til at generere Z-projektioner fra billedstakke.
Representative Results
Nethindeopdeling bevarer fotoreceptorterminaler
For at bekræfte, at retina-opdeling ikke beskadiger dendritterne af andenordens neuroner i OPL, blev lodrette sektioner af splittede nethinden farvet med antistoffer mod det synaptiske vesikelprotein synaptophysin (grøn) og proteinkinase C alfa (PKCα; rød). Det intense bånd af synaptophysinmærkning over toppen af den delte nethinden indikerer, at fotoreceptorsynaptiske terminaler bevares (figur 2). Desuden afslører PKCα-farvning normal morfologi af stangbipolære celler (RBC'er). Ingen fotoreceptorkerner er synlige, hvilket indikerer, at nethinden er delt mellem OPL og den inderste række af fotoreceptorcellelegemer (figur 2).
Figur 2: Opdelte nethinden bevarer fotoreceptorterminaler. Fluorescerende konfokale mikrografier, der viser et lodret tværsnit af en spytnethinden, der blev kryosektioneret (20 μm tykkelse) efter opdelingsproceduren. Hvert billede er en maksimal projektion af en konfokal z-stak. Sektionen blev immunmærket med antistoffer mod PKCα (øverst i midten) og synaptophysin (øverst til højre) for at visualisere henholdsvis RBC'er og synaptiske vesikler. Det fusionerede billede (nederst) viser synaptiske vesikler (grøn), som befinder sig i fotoreceptorterminalerne, lige over de apikale processer i RBC'erne (rød) i OPL. Cellekerner er mærket med DAPI (blå). Ingen fotoreceptorkerner er synlige inden for ONL. Forkortelser: ONL = ydre kernelag; OPL = ydre plexiformlag; INL = indre kernelag; IPL = indre plexiformlag; GC = ganglionceller. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Synapsemorfologi i OPL bevares efter retina-opdeling
Ved hjælp af en mus, der udtrykker GFP i RBC'er under pcp2-promotoren, blev 14 præ- og postsynaptiske proteiner i OPL immunmærket for at vurdere integriteten af dette synaptiske lag efter en split14. På trods af forskydningskræfterne, der forekommer gennem fotoreceptorernes axoner, forstyrrer opdeling ikke morfologien af fotoreceptor-BC-synapser i OPL, da normal positionering af RBC-dendritter, mærket til RGS11, og fotoreceptorsynaptiske bånd, mærket til CtBP215, observeres (figur 3). For hver synaptisk kontakt mellem stænger og RBC'er kan RGS11 ses som rød punkt, der ligger inden for hesteskoformen på de synaptiske bånd (grøn). I et efterfølgende eksperiment blev et anti-GPR179-antistof 16 brugt til at mærke de postsynaptiske ON-BC dendritiske spidser16, og et anti-PSD-95-antistof blev brugt til at mærke præsynaptiske stangfotoreceptorterminaler (supplerende figur 2). Disse resultater bekræfter igen stabiliteten af OPL i det delte nethindepræparat, da RBC-dendritter har vist sig at være tæt forbundet med deres præsynaptiske partner, stangterminalerne.
Figur 3: Synapsemorfologi i OPL bevares efter retina-opdeling. Konfokale immunfluorescensbilleder af en delt nethinden fra en transgen mus, der udtrykker GFP i RBC'er under Pcp2-promotoren. Niveauer af GFP-ekspression (blå) varierer på tværs af RBC'er i nethinden. Efter opdeling blev nethinden fikseret og derefter inkuberet med antistoffer mod CtBP2 (grøn) og RGS11 (rød) for at mærke henholdsvis fotoreceptorsynaptiske bånd og ON-BC dendritiske spidser. Hvert rødgrønt par repræsenterer en synaptisk kontakt mellem en stang og en ON-BC. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Nethindeopdeling opretholder RBC-levedygtighed
For at vurdere levedygtigheden af de indre retinale neuroner efter en opdeling blev der anvendt et membran uigennemtrængeligt, nær-infrarødt nukleært farvestof (MI-NIR), som muliggør identifikation af døde celler. Efter inkubation med MI-NIR blev splittede nethinden fikseret og derefter mærket med anti-PKCα for at identificere RBC'er. Konfokale mikrografier af den delte nethinden afslører regional variation i cellelevedygtighed på tværs af vævet, hvor nogle regioner oplever højere celledød end andre. Denne variation kan skyldes skader påført visse områder af nethinden under dissektions-, opdelings- eller håndteringsprocedurerne (figur 4). Da RBC'ernes cellelegemer befinder sig i INL's yderste region, tæt på det sted, hvor opdelingen fandt sted, var det berettiget at foretage en omhyggelig vurdering af deres levedygtighed. Knappe colokalisering af PKCα og MI-NIR bekræftede, at de fleste RBC'er forbliver levedygtige efter retina-opdeling (figur 4).
Figur 4: Stangbipolære celler er levedygtige efter retina-opdeling. Fluorescerende konfokale mikrografier, der viser et område af en delt nethinden i et fladt perspektiv. Efter spaltning blev den levende nethinde inkuberet med MI-NIR-farvestof (rød) i 30 minutter ved 37 °C. Nethinden blev derefter fikseret og immunmærket med antistoffer mod PKCα for at visualisere RBC'er. I denne region af nethinden er colokalisering af PKCα og MI-NIR sjælden. MI-NIR colokaliserer med kerner (blå), der ikke tilhører RBC'er. Forkortelser: MI-NIR = membran uigennemtrængelig NIR levende / død plet. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Split nethinden er modtagelige for dobbelt FISH og IHC
Ved at forlænge fikseringstiden for standard IHC kan split nethinden sekventielt behandles af FISH og IHC for at mærke mRNA'er og proteiner samtidigt17,18. Eksperimenter bekræftede, at en 2 timers fiksering i 4% paraformaldehyd giver robust mRNA-mærkning, mens proteinepitoper stadig bevares til antistofbinding. FISH blev udført på split nethinden efterfulgt af IHC for at visualisere ekspressionen af GABA A-receptorunderenheden δ (GABRD; anti-sense mRNA-sonder) i forhold til placeringen af RBC'er (anti-PKCα-antistof) i den ydre INL (figur 5A). GABRD mRNA-ekspression forekommer sjælden i RBC'er (figur 5A); transkriptet udtrykkes imidlertid rigeligt af amakrinceller og ganglionceller, som det fremgår af mærkningsmønsteret på tværgående sektioner fra en intakt nethinden (figur 5B). I den ydre INL (figur 5A) er GABRD mRNA mere jævnt fordelt sammenlignet med den indre INL (figur 5C), hvor den er koncentreret i forskellige celler. Antisense-sonder rettet mod andre GABA-receptorunderenheder producerer forskellige mærkningsmønstre, der viser sondernes specificitet (data ikke vist).
Figur 5: Dual FISH og IHC i en delt nethinde og en intakt nethinde. (A, C) Konfokale mikrografier af en fladmonteret split nethinden og (B) en lodret sektion fra en intakt nethinde. Billeder i (A) og (C) er maksimale projektioner af optiske sektioner i henholdsvis de øvre og nedre regioner af INL. De stiplede rektangler i (B) repræsenterer de omtrentlige grænser, der bruges til at skabe projektionerne vist i (A) og (C). Den delte nethinden (A, C) blev fastgjort i 2 timer og derefter mærket med antisense mRNA-sonder mod GABRD (rød). Derefter blev den delte nethinden farvet med antistoffer mod PKCα for at mærke RBC'er (grøn). PKCα-kanalen blev udeladt fra fremskrivninger af den nedre INL for klarhedens skyld. Den intakte nethinde i (B) blev fikseret i 24 timer før sektionering. Derefter blev den faste nethinden mærket med antisense mRNA-sonder mod GABRD (rød). Alle prøver blev farvet med DAPI (blå) i 20 sek. før montering af dæksel. Forkortelser: INL = indre kernelag. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Split nethinden er velegnet til patch-clamp elektrofysiologi optagelse fra BC'er og HC'er
For at lappe en BC eller HC soma i en traditionel helmonteret nethinde, skal pipetten nærme sig fra enten ganglioncellesiden eller fotoreceptorsiden. Begge fremgangsmåder kræver, at man krydser flere retinale lag for at nå INL, hvor pipettespidsen ofte bliver blokeret af snavs. I et vibratomskivepræparat er BC- og HC-somaerne let tilgængelige, men deres dendritiske processer kan afbrydes og forstyrre deres laterale forbindelser. I splittede nethinden sidder cellelegemerne i RBC'er og HC'er imidlertid på vævets overflade, hvilket giver stærkt forbedret adgang til patchpipetter, samtidig med at OPL's laterale kredsløb bevares.
Figur 6 viser kemisk simulerede lysresponser registreret fra BC'er i en delt nethinde. Perfuseret Ames-medium blev suppleret med L-AP4 (4 μM), en gruppe III mGluR-agonist, for at simulere glutamatfrigivelse fra fotoreceptorer i mørke. mGluR6-antagonisten, CPPG (600 μM, i Ames), blev pustet på dendritterne i den lappede celle (holdt ved -60 mV) for at simulere et lysglimt via hæmning af mGluR6. Celler reagerede på CPPG-pust med to typer indadgående strømme. En type viser en forbigående strøm efterfulgt af et plateau (figur 6A), svarende til de kanoniske lysfremkaldte strømme registreret fra RBC'er i retinale skiver19. Den anden type forbliver vedvarende under hele puffvarigheden (figur 6B) og ligner strømme registreret fra ON keglebipolære celler (ON-CBC)19.
Et separat eksperiment blev udført for at målrette HC'er, en celletype med et bredt dendritisk felt, der ofte er vanskeligt at bevare i skivepræparater. En muselinje, der udtrykker kanalrhodopsin (ChR2) og GFP i HC'er, blev brugt til at lette identifikationen under et fluorescensmikroskop. Først blev strømme fra HC'er registreret som reaktion på en række depolariseringstrin (-100 mV til 50 mV, trinstørrelse = 15 mV), som de reagerede på med indadgående strømme efterfulgt af udadgående strømme (figur 6C). Disse celler blev derefter stimuleret med en kort blå lyspuls (200 ms, 470 nm), der producerede store, ChR2-drevne indadgående strømme i to celler (figur 6D).
Figur 6: Patch clamp optagelser fra INL neuroner i split nethinder. (A) En formodet RBC og (B) CBC blev spændingsfastspændt ved -60 mV i perfuserede Ames-medier indeholdende L-AP4 (4 μM). Puffing CPPG (600 μM) på dendritterne i de fastspændte celler påkaldte en indadgående strøm, som var forbigående i RBC, men opretholdt i CBC. RBC-optagelsen i (A) er et enkelt spor, mens CBC-optagelsen i (B) repræsenterer gennemsnittet af 3 spor. C) En plasterklemme, der optages fra en HC i en vGATFLPo vGlut2Cre; Ai80d mus. Den røde linje viser varigheden af en 200 ms, 470 nm lyspuls, der bruges til at påkalde den store, indadgående strøm gennem ChR2. (D) Indsprøjtede strømresponser fra en HC, der var spændingsfastspændt ved -60 mV, derefter trådte mellem -70 mV og +35 mV i 15 mV-intervaller og vendte tilbage til -60 mV. Indsatsen viser de samme spor i et 6 ms vindue omkring starten af spændingstrinnet. E) Immunofluorescerende mikrografi af en fladmonteret splittet nethinde, der viser vandrette celler, der udtrykker GFP i en vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d mus. Skalabjælke = 20 μm. Elektrofysiologiske data blev indsamlet med en 20 kHz samplinghastighed og filtreret med et lavpas-Bessel-filter ved 5 kHz. Data blev derefter eksporteret, og offline visualisering og analyse blev udført ved hjælp af Python 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Nethindeopdeling muliggør hurtig forhør af INL- og OPL-anatomi
Nethindens ydre begrænsende membran (ELM) og ONL omfatter en barriere ~ 90 μm tyk, hvilket forhindrer diffusion af antistoffer i den indre nethinden og skaber suboptimale immunfarvningsbetingelser20,21,22. Derfor kræver immunmærkningsmål i OPL eller INL ved hjælp af en konventionel fladmonteret nethinden tidskrævende farvningsprotokoller, der ofte kræver 48-96 timers antistofinkubationer 5,6,7,8,20,22.
Fjernelse af fotoreceptorerne muliggør hurtig antistofindtrængning af indre retinale neuroner. Som følge heraf kan mærkning af indre retina-proteinmål opnås på så lidt som 1 time ved brug af farvestofkonjugerede primære antistoffer. Antistoffer mod PKCα og Calbindin-D blev anvendt til at mærke henholdsvis RBC'er og HC'er i INL (figur 7). I modsætning til traditionelle lodrette nethindesektioner, der afkorter de laterale processer i vidvinkelneuroner, muliggør det delte nethindepræparat visualisering af den fulde dendritiske arbor af vidfeltceller såsom HC'er (figur 6E, figur 7).
Figur 7: Hurtig immunmærkning af indre nethindeproteiner i en delt nethinde. Konfokale immunfluorescensbilleder af en delt nethinde fra et flatmount perspektiv. Den delte nethinde blev inkuberet med antistoffer mod PKCα (gul) og Calbindin-D (grøn) i 1 time ved stuetemperatur for at mærke henholdsvis ON-BC'er og HC'er. (A) Hvert enkelt kanalbillede er en gennemsnitlig Z-projektion sammensat af fire optiske sektioner: DAPI, Gennemsnitlig z10-13; Calbindin-D, gennemsnit z11-14; PKCα, gennemsnit z11-14. (B) I det fusionerede billede er de samme projektioner overlejret. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Nøglestadier af nethindedissektionen. Alle billeder blev taget med et smartphone-kamera monteret på de okulære linser i et dissektionsmikroskop. (A) Et top-down billede af et museøje efter fjernelse af hornhinden. (B) Et top-down-billede af musens øjekop, efter at linsen er fjernet. (C) Der foretages et lille snit i sclera på musens øjekop. Pile angiver de to klapper af sclera, som trækkes i modsatte retninger af tang for at begynde at adskille nethinden fra sclera. (D) Efter at sclera er delvist trukket væk fra nethinden, indsættes Vannas saks mellem sclera og nethinden, og synsnerven skæres over, hvilket frigør nethinden. Den røde stiplede cirkel viser synsnervehovedet, og saksen viser den korrekte skærebane (indsæt saks mellem sclera og nethinden). Den isolerede nethinden efter sclera er pried væk. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Karakterisering af præ- og postsynaptiske komponenter i OPL i den delte nethinde. Konfokale immunfluorescensbilleder fra OPL i en delt nethinden. Den delte nethinden blev inkuberet med antistoffer mod GPR179 og PSD95 i 1 time ved stuetemperatur for at mærke til henholdsvis dendritiske spidser af ON-BC'er og terminalerne på stangfotoreceptorer. De venstre og midterste billeder er maksimale fremskrivninger af flere optiske sektioner; De samme projektioner er overlejret i billedet yderst til højre. GPR179 puncta i ON-BC dendritiske spidser ses at være tæt forbundet med stangfotoreceptorterminalerne, hvilket viser intakte synaptiske kontakter inden for OPL. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Fejlfinding: vurdering af kvaliteten af en delt nethinde. Fluorescerende mikrografier af en delt nethinden farvet med DAPI for at visualisere cellekerner. Celler kan identificeres ud fra kernens diameter og vævsdybde. (A) Fotoreceptorkerner er mindre, lysere og mere overfladiske, mens (B) BC-kerner er større, svagere og dybere. (C) Et billede med lav forstørrelse af et område, hvor fotoreceptorer blev fjernet ufuldstændigt. De kerner, der vises i fokus, er fra BC'er, som er dybere end fotoreceptorkernerne på kanterne af billedet, der ser ud til at være ude af fokus. Skalastænger for (A) og (B) = 20 μm. Skalabjælke for (C) = 50 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Efter fotoreceptorer transducerer fotonabsorption til neurotransmitterfrigivelse, er BC'er og HC'er de første retinale neuroner, der behandler det visuelle signal23. Mens betydningen af disse neuroner er værdsat, er mange af deres funktioner ufuldstændigt forstået eller uudforsket helt. Mange BC- og HC-fysiologiske undersøgelser ville sandsynligvis drage fordel af et fladmonteret nethindepræparat, der forbedrer adgangen til INL-neuroner, samtidig med at lateral forbindelse bevares. Udviklingen af split retina-metoden repræsenterer et forsøg på at give en nem protokol til indsamling af elektrofysiologiske optagelser og mikroskopidata af høj kvalitet fra BC'er og HC'er i en flatmount orientering. Det delte nethindepræparat, der er beskrevet her, kan udføres på ca. 20 min pr. mus (10 min pr. nethinde) efter nethindeisolering uden brug af specialudstyr. Metoden henter inspiration fra eksisterende procedurer for fjernelse af fotoreceptorer, men tilbyder betydelige forbedringer i enkelhed, hastighed og alsidighed 4,10,11,12,13. I modsætning til tidligere metoder til adskillelse af retinale lag kræver retina-opdeling ikke frysning, frysetørring eller gentagen påføring af klæbemidler på nethinden. Med praksis kan næsten alle fotoreceptorer fjernes i en enkelt tåre med nitrocellulosemembranen. Hastigheden og letheden ved denne tilgang gør det muligt at minimere den tid, nethinden bruger ud af carbogenated Ames, hvilket muliggør høj cellelevedygtighed i lange perioder; splittede nethinden kan opretholdes i carbogenated Ames medier i flere timer efter split. Som et vidnesbyrd om INL-neuronernes sundhed i dette præparat bekræfter en levende / død celleplet (figur 4) og patch-clamp elektrofysiologi (figur 6) levedygtigheden af RBC'er og HC'er efter en split.
Fjernelsen af fotoreceptorlaget i splittede nethinden giver en betydelig fordel under immunmærkning ved dramatisk at reducere diffusionstiden for antistoffer i INL. Primær og sekundær antistofmærkning kan afsluttes inden for 2 timer, en væsentlig forbedring af konventionel flatmount-farvning, som kan tage 72 timer eller længere afhængigt af målet 5,6,7,8,20,22. Som et resultat kan mikroskopidata erhverves samme dag som vævspræparation, hvilket drastisk fremskynder tempoet i immunofluorescensforsøg. For at lette udglødning af mRNA-sonde anbefaler FISH-eksperimenter typisk meget længere fikseringstider (~ 24 timer) end immunmærkning18. De eksperimenter, der præsenteres her, viser imidlertid, at en 2 timers fiksering stadig producerer enestående FISH-mærkning (figur 5). På trods af at fikseringstiden blev forlænget fra 30 min til 2 timer, var det ikke nødvendigt at udføre antigenhentningstrin for at opnå fremragende immunmærkning, men dette kan variere med antistoffet eller antigenet. Proteasebehandlingen i FISH-protokollen kan forstyrre antistofmærkning, sandsynligvis på grund af ødelæggelsen af målepitoper. Dette problem blev omgået ved at bruge polyklonale antistoffer, der er målrettet mod flere epitoper, hvilket reducerer sandsynligheden for, at epitopdestruktion ville hindre immunmærkning. Derudover blev en moderat proteasebehandling (ACD protease III) brugt til at forhindre overdreven epitopændring, mens den stadig gav tilstrækkelig vævspenetration.
Lejlighedsvis vil nethinden i stedet splitte gennem det ydre nukleare lag (ONL) og efterlade lag af fotoreceptorsomas uden synlige INL-celler. For at forhindre dette bør man sikre sig, at nethinden ligger helt fladt på glasset, og at eventuel resterende væske fra omkring nethinden er fjernet. At trykke mere fast på nitrocellulosen med penslen kan også hjælpe med at forhindre opdeling gennem ONL. Hvis membranen bliver for våd, eller nethinden foldes over sig selv, vil chancerne for en vellykket opdeling blive stærkt reduceret. Brug af DAPI til at plette cellekerner er nyttig til vurdering af kvaliteten af opdelingen og til bestemmelse af dækningen af resterende fotoreceptorer. Fotoreceptorkerner er mindre, lysere og mere overfladiske (supplerende figur 3A), mens BC-kerner er større, svagere og dybere (supplerende figur 3B). I nogle tilfælde vil tåreplanet variere lidt over nethinden, hvilket resulterer i pletter, hvor fotoreceptorer cellelegemer ikke er blevet fjernet fuldstændigt (supplerende figur 3C). For anvendelser inden for mikroskopi og elektrofysiologi hindrer dette ikke muligheden for at indsamle kvalitetsdata fra regioner, hvor fotoreceptorer er blevet fjernet korrekt; Store felter af eksponeret indre nethinden kan let findes ved billeddannelse eller optagelse med en plasterpipette. Hvis der ønskes mere fuldstændig fjernelse af fotoreceptorer, kan en anden tåre udføres med et ekstra stykke nitrocellulosemembran, selvom 100% fotoreceptorfjernelse ikke garanteres. Forsigtighed tilrådes derfor, når der anvendes splittede nethinden i genekspression eller proteomiske undersøgelser, hvor resterende fotoreceptormateriale kan påvirke resultaterne. For enkeltcelleapplikationer er denne bekymring uberettiget, da data fra fotoreceptorer kan udelukkes fra analyse.
Fordelene ved split retina præparatet er måske mest fremtrædende i elektrofysiologiske optagelser af wide-field interneuroner. Mens traditionelle lodrette skiver adskiller de omfattende processer i vidvinkelceller, efterlader det delte nethindepræparat OPL og IPL intakt, så man kan fange input fra vidvinkelceller som HC'er 24, A17s 25, TH AC'er26 og NOS-1 AC'er27, der ellers ville blive overset i lodrette skiver. Derfor kræver fortolkning af resultater og sammenligning med tidligere data indsamlet fra retinale skiver omhyggelig overvejelse. Ikke desto mindre ligner disse resultater i eksperimenter, der bruger farmakologiske efterligninger af lysstimulering, data registreret fra retinale skiver19. Ved at udtrykke ChR2 under cellespecifikke promotorer kan man stimulere en ønsket cellepopulation, mens man optager fra BC'er i INL for at undersøge den ønskede celles indvirkning på den vertikale informationsvej. Optagelse direkte fra dybere INL-neuroner, såsom amakrinceller, er også mulig i den delte nethinden. Mens plasterelektroden i dette tilfælde først skal rejse gennem de mere overfladiske INL-neuroner, er der betydeligt mindre væv, der forhindrer dens vej sammenlignet med et traditionelt helmonteret præparat.
Ud over at måle indflydelsen af vidvinkelceller på andre neuroner muliggør denne metode direkte enkeltcelleplasterfastspænding fra HC'er, hvis dendritter danner et omfattende gap-junction-koblet netværk i OPL28. Vandrette celler sender kritisk feedback til fotoreceptorer, som former transmissionen af lodret information gennem nethinden. Men da de dendritiske felter af HC'er afkortes i lodrette skiver, mangler enkeltcelleoptagelsesdata. Dette arbejde præsenterer anatomisk og fysiologisk intakte HC'er, hvorfra ChR2-fremkaldte strømme registreres i en tredobbelt transgen muselinje (figur 6 C-E). Uden for ChR2-stimulering kan den delte nethinden bruges til at studere endogene HC-strømme og gap junctioncoupling 28. Mens den delte nethinden giver en bekvem model til at studere synaptisk forbindelse og neuronal aktivitet induceret af kemisk applikation eller ChR2-stimulering, udelukker manglen på fotoreceptorer enhver direkte udforskning af naturlige lysresponser eller lystilpasningsmekanismer.
In situ billeddannelse i nethinden har gjort beundringsværdige fremskridt i de senere år. Imidlertid er størstedelen af billeddannelsesundersøgelser begrænset til ganglioncellelaget i helmonterede nethindepræparater29. Forfatterne forestiller sig, at fraværet af fotoreceptorer i den delte nethinden vil gøre det til en ideel model for levende calciumbilleddannelse i OPL og INL. Ud over calciumbilleddannelse har denne model et stort potentiale til brug med genetisk kodede biosensorer såsom iGluSnFR 30,31, iGABASnFR32 og pHluorin33. Kombineret med split retina præparatet kan disse kraftfulde værktøjer tilbyde en effektiv tilgang til at udforske de synaptiske interaktioner og biofysiske egenskaber hos BC'er og HC'er, der bidrager til lysbehandling i nethinden.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af følgende NIH-tilskud: NIH-tilskud R01EY031596 (til C.M.); NIH-tilskud R01EY029985 (til C.M.); NIH-tilskud P30EY010572 (til C.M.); NIH-tilskud R01EY032564 (til BS). Vi takker Tammie Haley for hendes tekniske støtte til forberedelse af nethindesektioner og Dr. Charles Allen for generøst at bidrage med mRNA FISH-sonder, der bruges i dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
| 2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
| 470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
| 5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
| 9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
| Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
| Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
| amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
| anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
| anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
| anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
| anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
| carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
| custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
| Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
| dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
| HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
| Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
| Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
| Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
| Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
| Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
| medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
| Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
| Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
| mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
| nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
| Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
| plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
| Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
| platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
| size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
| SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
| small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
| small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
| Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
| Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
| vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
| vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |
References
- Morgans, C. W. Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina. Immunology & Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).
- Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision. Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).
- Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro. Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).
- Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).
- Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Chédotal, A., Kolodkin, A. L. Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina. Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).
- Matsuoka, R. L., et al. Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina. Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).
- Wässle, H., Puller, C., Müller, F., Haverkamp, S. Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina. Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).
- Thoreson, W. B., Dacey, D. M. Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina. Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Todorova, V., et al. Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina. Scientific Reports. 12 (1), 20195 (2022).
- Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture. Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).
- Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).
- Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -J. Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol. Methods in Molecular Biology. 2148, Clifton, N.J. 301-312 (2020).
- Wang, F., et al.
- Morgans, C. W., et al. TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).
- Alessio, E., Zhang, D. Q. Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (7), 5054 (2020).
- Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT. PLoS ONE. 8 (6), e67265 (2013).
- Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018 (2013).
- Kolb, H.
- Chaya, T., et al. Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit. Scientific Reports. 7 (1), 5540 (2017).
- Egger, V., Diamond, J. S. A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537 (2020).
- Dacey, D. M.
- Park, S. J., et al. Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision. eLife. 9, 56077 (2020).
- Janssen-Bienhold, U., et al. Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light. The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).
- Jain, V., et al. The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells. eLife. 9, 52949 (2020).
- Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
- Strauss, S., et al. Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina. Nature Communications. 13 (1), 5574 (2022).
- Marvin, J. S., et al. A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA. Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).
- Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).
