Summary
Das Protokoll erläutert zwei verschiedene Dezellularisierungsmethoden, die auf natives Lungengewebe von Rindern angewendet werden, und bietet eine umfassende Darstellung ihrer jeweiligen Charakterisierungen.
Abstract
Die Verwendung von Hydrogelen aus extrazellulärer Matrix (ECM) im Tissue Engineering wird immer beliebter, da sie die natürliche Umgebung von Zellen in vitro nachahmen können. Die Aufrechterhaltung des nativen biochemischen Gehalts der ECM, das Erreichen mechanischer Stabilität und das Verständnis der Auswirkungen des Dezellularisierungsprozesses auf die mechanischen Eigenschaften der ECM-Hydrogele sind jedoch eine Herausforderung. Hier wurde eine Pipeline zur Dezellularisierung von Rinderlungengewebe unter Verwendung von zwei verschiedenen Protokollen, der nachgeschalteten Charakterisierung der Wirksamkeit der Dezellularisierung, der Herstellung von rekonstituierten dezellularisierten Lungen-ECM-Hydrogelen und der Bewertung ihrer mechanischen und zytokompatiblen Eigenschaften beschrieben. Die Dezellularisierung der Rinderlunge wurde mit einer physikalischen (Gefrier-Tau-Zyklen) oder chemischen (auf Detergenzienbasis) Methode durchgeführt. Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen wurden durchgeführt, um die Dezellularisierung und Retention der wichtigsten EZM-Komponenten zu validieren. Für die Bewertung des Restgehalts an Kollagen und sulfatiertem Glykosaminoglykan (sGAG) in den dezellularisierten Proben wurden Sirius-Rot- bzw. Alcianblau-Färbetechniken eingesetzt. Die mechanischen Eigenschaften der dezellularisierten Lungen-ECM-Hydrogele wurden durch oszillatorische Rheologie charakterisiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dezellularisierte Rinderlungenhydrogele eine zuverlässige organotypische Alternative zu kommerziellen ECM-Produkten darstellen können, indem sie die meisten nativen ECM-Komponenten beibehalten. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass die Dezellularisierungsmethode der Wahl die Gelierungskinetik sowie die Steifigkeit und viskoelastischen Eigenschaften der resultierenden Hydrogele signifikant beeinflusst.
Introduction
Herkömmliche Monolayer-Kulturbedingungen bieten keine originalgetreue Darstellung der nativen Gewebemikroumgebungen und sind nicht in der Lage, ein dreidimensionales (3D) Gerüst mit instruktiven Liganden bereitzustellen, die Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktionen ermöglichen1. Die Zusammensetzung und die mechanischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix (ECM) sind sehr gewebespezifisch, zeitabhängig und unterliegen Veränderungen in pathologischen Zuständen. Daher besteht ein Bedarf an biomimetischen 3D-Gewebemodellen, die die Abstimmbarkeit solcher Eigenschaften, die Modulation des zellulären Verhaltens und das Erreichen der gewünschten Gewebefunktionalität ermöglichen. Native ECM-abgeleitete Biomaterialien ziehen im Tissue Engineering viel Aufmerksamkeit auf sich, da sie gewebespezifisches ECM direkt verwendenkönnen 1,2,3,4,5. ECM-basierte Träger wurden in vielen Anwendungen eingesetzt, von der Geweberegeneration bis zur Entwicklung von Krankheitsmodellen. Sie werden als injizierbare oder implantierbare Biomaterial-Gerüste 4,5, in Wirkstoff-Screening-Anwendungen 6,7, bei der Entwicklung von Materialien, die das Zellwachstum induzieren 8,9,10, als Biotinten 11,12,13, in der Mikrofluidik 14 und in Krebsgewebemodellen 15,16,17 verwendet,18,19.
Die Dezellularisierung von Geweben und Organen ist ein beliebter Ansatz zur Erzeugung von Gerüsten, die gewebespezifische EZM nachahmen. Die Rekonstitution von dezellularisierten Geweben und Organen in Hydrogele ermöglicht die Einbettung von Zellen in biomimetische 3D-Gewebemodelle20. Dezellularisierungstechniken konzentrieren sich hauptsächlich auf die Eliminierung zellulärer Komponenten unter Beibehaltung der EZM-Zusammensetzung. Physikalische Methoden wie Gefrier-Tau-Zyklen oder chemische Prozesse wie die Triton-X-100-Behandlung werden häufig zur Dezellularisierung von Geweben angewendet. Darüber hinaus wird die DNase-Behandlung bevorzugt, um verbleibende DNA zu entfernen, um die immunologischen Reaktionen bei der Zelleinbettung zu minimieren. Es ist entscheidend, eine maximale Zellentfernung und eine minimale ECM-Beeinträchtigung zu erreichen, um die Dezellularisierungsverfahren zu optimieren21. Neben diesen Aspekten ist die Charakterisierung der biochemischen und mechanischen Eigenschaften von rekonstituierten Gerüsten, einschließlich Viskoelastizität und Steifigkeit, entscheidend für die Verbesserung von 3D-Gewebemodellen, die aus nativen Matrizen abgeleitet wurden20.
Organspezifische EZM im Lungengewebe-Engineering ermöglicht die Nachahmung der pulmonalen Mikroumgebung, um Entwicklungs-, homöostatische oder pathologische Prozesse in vitro zu modellieren und Therapeutika in einer physiomimetischen Umgebung zu testen 20,22,23. Frühere Studien haben die Dezellularisierung von Lungengewebe von mehreren Spezies wie Ratten, Schweinen und Menschen gezeigt, aber diese Methoden müssen noch an weniger häufig verwendete Spezies wie Rinder angepasst werden. Ein besseres Verständnis der Parameter des Dezellularisierungsprozesses und wie sie sich auf die resultierenden rekonstituierten ECM-Gerüste in Bezug auf biochemische Zusammensetzung und mechanische Eigenschaften auswirken, wird eine bessere Abstimmung dieser Aspekte ermöglichen und den Weg für zuverlässigere Gewebemodelle in Gesundheit und Krankheit ebnen. In dieser Studie wird die Dezellularisierung der Rinderlunge mit zwei verschiedenen Methoden, Gefrier-Auftau-Zyklen und Triton-X-100-Behandlung, explizit beschrieben und gefolgt von biochemischen und mechanischen Analysen von dezellularisierten Lungen-ECM-Hydrogelen (dECM). Die Ergebnisse zeigen, dass beide Methoden eine effektive Dezellularisierung und Retention von EZM-Liganden ermöglichen. Insbesondere verändert die Wahl der Methode die resultierende Steifigkeit und Viskoelastizität von rekonstituierten Hydrogelen erheblich. Hydrogele, die aus der Rinder-dECM gewonnen werden, zeigen bemerkenswerte biochemische Analogien mit der extrazellulären Matrix der menschlichen Lunge und sie weisen zuverlässige thermische Gelierungseigenschaftenauf 20. Wie bereits beschrieben, eignen sich beide Verfahren für die 3D-Kultur von Lungenkrebszellen, gesunden Bronchialepithelzellen und patienteneigenen Lungenorganoiden20.
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Protocol
Frische einheimische Lungen von jungen (1-2 Jahre alten) Rinderspendern wurden aus einem örtlichen Schlachthof gewonnen und in einem versiegelten Plastikbehälter auf Eis ins Labor transportiert. Tieropfer werden für den allgemeinen Fleischkonsum (Lunge wird als Abfall entsorgt) durchgeführt und stehen nicht im Zusammenhang mit oder aufgrund der Studie. Wir bestätigen, dass der Schlachthof die nationalen Gesetze und Vorschriften für Tieropfer einhält. Darüber hinaus bestätigen wir, dass wir nur Abfallmaterial verwendet haben und das Forschungsprojekt keinen Einfluss auf die Anzahl der getöteten Tiere hatte.
1. Organentnahme und Gewebepräparation
- Frisch gewonnenes Rinderlungengewebe bis zum Versuch bei -80 °C lagern.
- Warten Sie am Tag des Experiments, bis gefrorenes Lungengewebe bei Raumtemperatur aufgetaut ist.
- Sezieren Sie das Gewebe mit sterilen Skalpellen und Scheren, um Luftröhre und knorpelige Atemwege zu entfernen, und hacken Sie es weiter in kleine Stücke (5 mm3).
- Mindestens 3x gründlich mit Reinstwasser waschen, das 2% Penicillin/Streptomycin (P/S) enthält.
2. Dezellularisierung von Geweben
HINWEIS: Natives Rinderlungengewebe wurde mit zwei verschiedenen Protokollen dezellularisiert.
- Gefrier-Auftau-Methode
- Bereiten Sie Gewebeproben gemäß Schritt 1 vor. Tauchen Sie das gehackte Gewebe 1 Minute lang in 2%ige Jodlösung in sterilem destilliertem Wasser (dH2O). Führen Sie zwei aufeinanderfolgende Wäschen in sterilem dH2O durch.
- Übertragen Sie zerkleinerte Gewebestücke in ein 50-ml-Röhrchen bis zum 15-ml-Niveau und führen Sie fünf manuelle Gefrier-Tau-Zyklen mit einem tragbaren Flüssigstickstoffbehälter durch. Röhrchen bis zum Rand mit sterilem dH2O füllen und Röhrchen 2 min in flüssigem Stickstoff einfrieren. Nach 2 min sofort für 10 min in ein 37 °C warmes Wasserbad geben. Dies entspricht 1 Zyklus von Gefrieren und Auftauen.
- Die Proben werden mit 30 ml DNase-Lösung (10 U/ml) in 10 mM MgCl2-Puffer (pH 7,5) für 1 h bei 37 °C unter ständigem Schütteln bei 100 U/min inkubiert.
- Fahren Sie mit einer ausgiebigen Wäsche mit sterilem dH2O für 3 Tage unter ständigem Schütteln bei 100 U/min fort, wobei die Lösung alle 24 Stunden nachgefüllt wird.
- Führen Sie die Gefriertrocknung und Kryovermahlung wie folgt durch20: Frieren Sie die nassen dECM-Proben 24 h lang bei -80 °C ein. Gefrorene Proben in einen Gefriertrockner geben und 3 bis 4 Tage lang im Trocknungsmodus unter Vakuum arbeiten, bis sie vollständig getrocknet sind. Nach Abschluss der Gefriertrocknung werden die Proben mit einer Mahlvorrichtung und Trockeneis in eine feine Pulverform gemahlen.
HINWEIS: Dieser feine Pulverzustand wird aufgrund seiner verbesserten Löslichkeitseigenschaften in den nachfolgenden Phasen des Aufschlussprozesses als notwendig erachtet.
- Triton-X-100-Methode
- Bereiten Sie Gewebeproben gemäß Schritt 1 vor. Behandeln Sie das Lungengewebe mit 1% Triton-X-100 für 3 Tage unter sanfter Rotation bei 4 °C. Austauschlösung alle 24 h.
- Die Proben werden mit DNase-Lösung (10 U/ml) in 10 mM MgCl2-Puffer (pH 7,5) für 1 h bei 37 °C unter ständigem Schütteln inkubiert.
- Fahren Sie mit einer ausgiebigen Wäsche mit sterilem dH2O für 3 Tage unter sanfter Rotation fort, wobei die Lösung alle 24 h nachgefüllt wird.
- Führen Sie eine Lyophilisation gefolgt von einer Kryo-Vermahlung durch, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
3. Pepsin-Verdauung
- Verdauen Sie pulverförmige dECM-Proben in einer Konzentration von 15 mg/ml (w/v) in Pepsinlösung (1 mg/ml Pepsin in 0,01 M HCl, pH 2). Führen Sie den Probenaufschluss bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren für 48 Stunden durch und halten Sie den pH-Wert der Lösung häufig aufrecht, um einen effektiven Aufschluss zu erzielen.
- Die Aufschlüsse in ein Röhrchen geben und bei 5000 x g 10 min zentrifugieren.
- Sammeln Sie den Überstand und neutralisieren und puffern Sie ihn unter physiologischen Bedingungen (pH 7, 1x Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)) durch Zugabe von 5M NaOH und 10x PBS.
HINWEIS: Es wird empfohlen, konzentrierte alkalische Lösungen zur pH-Einstellung des sauren Aufschlusses zu verwenden, da dieser Ansatz eine unerwünschte Volumenausdehnung vermeidet, die sich nachteilig auf die Gelierung in den nachfolgenden Schritten auswirken könnte. - Lagern Sie die Pre-Gel-Aufschlüsse bei -20 °C für weitere Studien.
4. Histologische Färbung
- Eine kleine Portion (5 mm3) der dezellularisierten Gewebeprobe über Nacht in 1 ml 3,7%iger Formaldehydlösung bei 4 °C fixieren.
- Gewebe in Röhrchen mit 1 ml 30%iger Saccharoselösung in PBS 12 h bei 4 °C auf einem stabilen Gestein inkubieren.
- Um Gewebe in eine optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT) einzubetten, gießen Sie 1 ml OCT in ein Kryomold, legen Sie das Gewebe in die Mitte des Kryomolds und gießen Sie dann 2 ml OCT auf das Gewebe.
- Kryoformen mit Geweben auf Trockeneis legen und mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Die Proben sind fertig, wenn OCT ganz weiß wird, was normalerweise 3 Minuten dauert. Lagern Sie OCT-eingebettete Gewebe bis zur Verwendung bei -20 °C.
- 10 μm Schnitte im Kryostaten bei -25 °C auf einem Poly-L-Lysin-beschichteten Objektträger erhalten und den Objektträger auf Raumtemperatur bringen, damit der Gewebeschnitt auf dem Objektträger schmelzen kann. Lagern Sie die Objektträger bis zur Verwendung bei -20 °C.
- Um das Fehlen von Kernen nach der Dezellularisierung zu bestätigen, führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) wie unten beschrieben durch.
- Objektträger 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Tauchen Sie Objektträger in PBS und färben Sie sie 3 Minuten lang mit gebrauchsfertiger 50 ml Hämatoxylinlösung in einem Färbeglas, gefolgt von einer 3-minütigen Wäsche mit Leitungswasser.
- Tauchen Sie die Objektträger in 95% Ethanol und färben Sie sie 45 s lang mit 50 ml 0,5% alkoholischer Eosinlösung in einem Färbeglas.
- Führen Sie eine Sirius-Rotfärbung durch, um die Beibehaltung des Kollagengehalts nach der Dezellularisierung zu zeigen.
- Hydratisieren Sie die Objektträger mit PBS und tauchen Sie sie 1 h lang in 50 ml 0,1% Siriusrot in gesättigter wässriger Pikrinsäurelösung in einem Färbegefäß.
- Spülen Sie die Objektträger 5 s lang in 0,5%iger Essigsäurelösung und dehydrieren Sie alle Objektträger, indem Sie sie nacheinander 1 Minute lang in 70 %, 95 % und 100 % Ethanol einweichen.
- Um den sGAG-Gehalt in Gewebeproben zu analysieren, führen Sie die Alcian-Blau-Färbung wie unten beschrieben durch.
- Tauchen Sie die Objektträger 30 Minuten lang in 50 ml 1% Alcianblau in 3% Essigsäurelösung (pH 2,5) in ein Färbegefäß. Waschen Sie die Objektträger 2 Minuten lang mit fließendem Leitungswasser.
- Entwässern Sie alle Objektträger, indem Sie sie nacheinander 1 Minute lang in 70 %, 95 % und 100 % Ethanol einweichen.
- Geben Sie 0,1 ml Einbettmedium auf die Proben und visualisieren Sie sie mit Lichtmikroskopie und 10-facher Vergrößerung.
5. Mechanische Charakterisierung
- Implementieren Sie oszillatorische Rheologiemessungen mit einem Rheometer mit paralleler Plattengeometrie.
- Gießen Sie 250 μl der auf Eis aufbewahrten Pre-Gel-Lösung auf eine vorgekühlte (4 °C) untere Platte, um eine schnelle Gelierung zu vermeiden.
- Senken Sie die 20 mm parallele Platte ab, bis die Pre-Gel-Lösung eine Scheibe mit einer Spaltbreite von 1 mm zwischen den beiden Platten bildet.
- Starten Sie sofort die Messung. Messen Sie die Speicher- und Verlustmodule im Laufe der Zeit mit einer festen Frequenz und Dehnung, während Sie die untere Platte 30 Minuten lang auf 37 °C erhitzen, um die Gelierungskinetik zu beobachten. Verwenden Sie eine feste Frequenz von 0,5 Hz und 0,1 % Dehnung.
- Führen Sie einen Kriechwiederherstellungstest durch, nachdem der Wert des Speichermoduls nicht mehr ansteigt und ein Plateau erreicht.
- Wenden Sie 15 Minuten lang 1 Pa Scherspannung auf das Hydrogel an, messen Sie die Dehnung, entlasten Sie die Probe von der Spannung und zeichnen Sie die Änderung des Dehnungswerts für 15 Minuten auf.
- Zeichnen Sie ein Belastungs-Zeit-Diagramm, um das stressabbauende Verhalten zu zeigen. Wiederholen Sie die Messungen für drei verschiedene dECM-Digests als Replikate.
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Representative Results
Dezellularisierung
Die Dezellularisierung von Rinderlungengewebe zur Herstellung von dECM-Hydrogelen, die die native Lungenmikroumgebung rekapitulieren würden, wurde sowohl durch physikalische (Gefrier-Auftauen) als auch durch chemische (Triton-X-100) Methoden erreicht. Nach der Dissektion wurden Gewebestücke in dH2O-haltigen Antibiotika gewaschen, um Krankheitserreger zu entfernen, die später die Sterilität der dECM-Hydrogele beeinträchtigen können. Insgesamt fünf Zyklen im Wechsel zwischen flüssigem Stickstoff und 37 °C warmem Wasserbad wurden für die Gefrier-Tau-Methode angewendet, um zelluläre Strukturen aufzubrechen. Bei der zweiten Dezellularisierungsmethode wurden native Lungengewebestücke 3 Tage lang unter ständigem Rühren mit 1%iger Triton-X-100-Lösung behandelt. Bei beiden Methoden ist das Schneiden des Lungengewebes in kleine Stücke entscheidend, um die Diffusion von Lösungen in die Kernregionen sowie die physikalische Zerstörung des Kerninhalts zu ermöglichen. Als erster visueller Indikator für die Dezellularisierung verwandelte sich die rosa Farbe des Gewebes bei beiden Methoden mit wiederholten Zyklen in eine weißliche Farbe. Es ist auch wichtig, die verbleibende DNA zu entfernen, was mit der DNase-Behandlung in diesem Protokoll erreicht wurde. Darüber hinaus wurden die Gewebe nach der Dezellularisierung mit beiden Methoden 3 Tage lang ausgiebig in dH2O gewaschen, ergänzt mit Antibiotika, um die Sterilität des Gewebes zu erhalten. Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt ist, dass während der Neutralisation und Pufferung von dECM-Verdauen unter physiologischen Bedingungen alle Lösungen aus Sterilitätsgründen gefiltert und auf Eis gehalten wurden, um eine vorzeitige Gelbildung zu vermeiden. Die Bildung von Lungen-dECM-Hydrogelen wurde dann durch thermische Gelierung im letzten Schritt erreicht (Abbildung 1).
Kryoschnitte und histologische Färbungen
Fixierung und Kryoschnitte von nativem und dezellularisiertem Lungengewebe, gefolgt von indizierten histologischen Färbungen, wurden durchgeführt, um die Eliminierung von Zellkernen und die Retention von EZM-Molekülen nach der Dezellularisierung zu beurteilen (Abbildung 2A). Die H&E-Färbung zeigte eine signifikante Verringerung des Kerngehalts in dezellularisierten Proben sowohl mit der Freeze-Thaw- als auch mit der Triton-X-100-Methode im Vergleich zu nativem Gewebe, was darauf hindeutet, dass die Dezellularisierung sowohl durch physikalische als auch durch chemische Methoden erreicht wurde (Abbildung 2B). Die Sirius-Rotfärbung zeigte, dass das zurückgehaltene Kollagen in dezellularisiertem Gewebe mit dem nativen Gewebe vergleichbar war, was darauf hindeutet, dass beide Dezellularisierungsmethoden nur minimale Auswirkungen auf den Kollagengehalt hatten (Abbildung 2B). Darüber hinaus zeigte die Alcian-Blau-Färbung, dass der sGAG-Gehalt in dezellularisierten Geweben im Vergleich zu nativen Geweben effizient erhalten blieb (Abbildung 2B).
Mechanische Charakterisierung
Rheologische Messungen von dezellularisierten Lungenhydrogelen wurden mit einem 20 mm parallelen Plattenaufbau durchgeführt, um eine Hydrogelscheibe von 1 mm Dicke zu erhalten (Abbildung 3A). Frequenz-Sweep wurde verwendet, um die bei den Messungen verwendeten Dehnungswerte zu optimieren. Der durchschnittliche Speichermodul (G') und der Verlustmodul (G'') von Hydrogelen, die mit der Gefrier-Tau-Methode erhalten wurden, betrugen 204 Pa bzw. 28,4 Pa, was signifikant steifer war als Hydrogele, die mit der Triton-X-100-Methode erhalten wurden (Abbildung 3B-C). Interessanterweise zeigten Kriecherholungstests, dass Hydrogele, die mit Freeze-Tau- und Triton-X-100-Methoden erhalten wurden, unterschiedliche Reaktionen auf Stress zeigten, was bedeutet, dass Hydrogele unterschiedliche viskoelastische Eigenschaften haben (Abbildung 3D).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Dezellularisierungsprozesses. Rinderlungengewebe wurde in kleine Stücke zerlegt und gründlich gewaschen. Die Entfernung des zellulären Inhalts wurde mit zwei verschiedenen Methoden erreicht. Physikalische Methode mit sich wiederholenden Gefrier-Tau-Zyklen und chemische Methode mit Triton-X-100-Behandlung. Bei beiden Methoden wurde eine DNase-Behandlung durchgeführt, um verbleibende DNA zu entfernen; Nach der Lyophilisierung des dezellularisierten Gewebes wurden Kryomahlung, Pepsinverdau, Neutralisation und Gelierung durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kryoschnitt und Färbung von nativem und dezellularisiertem Rinderlungengewebe. (A) Native und dezellularisierte Rinderlungengewebestücke wurden mit 3,7%iger Formaldehydlösung fixiert, in 30%ige Saccharoselösung in PBS getaucht, dann in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) eingebettet und schockgefroren. Für jede Probe wurden 10-μm-Abschnitte auf Glasobjektträger montiert, um mit der Färbung fortzufahren. (B) Repräsentative Bilder von nativen und dezellularisierten Proben durch Gefrier-Auftau- oder Triton-X-100-Methoden. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) für Zellkerne, Sirius-Rot-Färbung für Kollagen und Alcian-Blau-Färbung für sGAGs wurden durchgeführt. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Messung der mechanischen Eigenschaften von dezellularisierten Lungen-EZM-Hydrogelen. (A) Repräsentatives Bild eines thermisch vernetzten dezellularisierten Lungenhydrogels nach mechanischer Charakterisierung. Die oszillatorische Rheologie wurde mit einem Rheometer mit paralleler Plattengeometrie durchgeführt. Rheologische Eigenschaften von dezellularisierten Hydrogelen, (B) Speichermodul (G'), (C) Verlustmodul (G''), (D) Kriecherholungstest zur Beurteilung des Spannungsrelaxationsverhaltens von Hydrogelen. Fehlerbalken stehen für s.d. (*p < 0,05), n=3. Ein ungepaarter t-Test mit Welchs Korrektur wurde für die statistische Analyse verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Aus Organen gewonnene Hydrogele sind zu vielversprechenden Modellen geworden, die die native Gewebe-EZM rekapitulieren und die organotypische Zellfunktion nachahmen. Obwohl dezellularisierte Lungen-EZM häufig im Tissue Engineering eingesetzt wurde, wird eine gründliche Charakterisierung der Biomaterialzusammensetzung und der mechanischen Eigenschaften zu einem besseren Verständnis beitragen, wie Zell-ECM-Interaktionen moduliert werden können, um biologische Prozesse während der Homöostase oder Krankheit zu modellieren. Insbesondere die Bewertung und Kontrolle der mechanischen Eigenschaften von rekonstituierten Hydrogelen, wie Steifigkeit und Viskoelastizität, ist von großer Bedeutung, da diese bei der Regulierung verschiedener zellulärer Phänomene impliziert wurden. Daher ist es wichtig, verschiedene Dezellularisierungsmethoden zur Herstellung von dECM-Hydrogelen in Bezug auf biochemischen Gehalt und mechanische Aspekte zu vergleichen und zu bewerten20,23. Hier wurde die Dezellularisierung der Rinderlunge mit zwei unterschiedlichen Ansätzen demonstriert: Gefrier-Tau-Zyklen, die hauptsächlich auf mechanischem Aufschluss und Entfernung des DNA-Gehalts basierten, sowie chemischer Entfernung des Kerninhalts mit einem gängigen Detergens, Triton-X-100 (Abbildung 1). Für das Gefrier-Auftau-Verfahren ist es wesentlich sicherzustellen, dass alle Gewebeproben eingefroren und in einem automatisierten und sich wiederholenden Weg zwischen flüssigem Stickstoff und Wasserbad ordnungsgemäß aufgetaut werden24. Um dies zu erreichen, konnten Gewebeproben in mehrere Röhrchen aufgeteilt und zum Einfrieren in den Stickstoffbehälter und dann zum Auftauen in ein Wasserbad versenkt werden. Der Wechsel der Triton-X-100-Lösung alle 24 Stunden ist entscheidend für die chemische Methode, um den zellulären Inhalt effektiv zu stören21. Die DNase-Behandlung wurde bei beiden Methoden verwendet, um den Abbau der verbleibenden DNA weiter zu verbessern, was die Lebensfähigkeit der verkapselten Zellen verringern könnte. Beide Methoden eliminierten erfolgreich zelluläres Material während der Dezellularisierung, wobei in beiden Fällen DNA-Spuren zurückblieben20. Insbesondere wurde berichtet, dass kommerziell erhältliche extrazelluläre Matrixprodukte in ähnlicher Weise geringe Mengen an Rest-DNA enthalten, die nach der Implantation keine nachteiligen Auswirkungen auf die Zytokompatibilität oder Immunantwort in Wirten haben, um sie in Tissue Engineering und translationalen Studien zu verwenden20,25.
Die EZM umfasst viele Protein- und Polysaccharid-Makromoleküle wie Kollagene, Elastine und Proteoglykane, die eine entscheidende regulatorische Rolle bei der zellulären Signalübertragung spielen26. Daher sollten native EZM-abgeleitete Gerüste die Retention solcher zellinstruktiven EZM-Liganden nachweisen. Zu diesem Zweck wurden Kollagen- und sGAG-Färbungen durchgeführt, um die EZM-Zusammensetzung von dezellularisierten Matrizen mit der von nativen Geweben zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Kollagen- und sGAG-Gehalt in dezellularisierten Geweben durch Gefrier-Auftau- und Triton-X-100-Dezellularisierungsmethoden erhalten blieb, was darauf hindeutet, dass sie eine native EZM-Mikroumgebung in rekonstituierten Gerüsten bieten20,26. Die strukturelle Organisation der EZM-Bestandteile zeigte trotz geringfügiger Unterschiede im EZM-Gehalt Unterschiede nach der Dezellularisierungsmethode. Obwohl repräsentative Bilder eine größere Ähnlichkeit zwischen der Dezellularisierung von Lungengewebe auf Detergenzbasis und nativen Lungengewebefärbungen zeigten, behielten beide Protokolle insgesamt erfolgreich native EZM-Proteine bei (Abbildung 2).
Mechanische Eigenschaften von 3D-Gewebemodellen spielen eine entscheidende Rolle in Zellkulturstudien, da sowohl das Wachstum als auch das Verhalten von Zellen stark von den mechanischen Eigenschaften der nativen EZM beeinflusst werden 27,28,29,30. Verschiedene Dezellularisierungsmethoden zeigen deutliche Auswirkungen auf den Gelierungsprozess und die endgültige Steifigkeit und Viskoelastizität von dECM-Hydrogelen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gefrier-Tau-Methode robustere und steifere Hydrogele erzeugt als die Triton-X-100-Methode. Darüber hinaus haben wir in unserer vorherigen Studie gezeigt, dass die Steifigkeit von Gefrier-Tau-dECM-Hydrogelen durch Modifikation der Ligandenkonzentration angepasst und an die Steifigkeit von Triton-X-100-abgeleiteten dECM-Hydrogelen gesenkt werden kann20. Viskoelastizität ist ein Merkmal nativer Gewebematrizen, das auf viskoses und elastisches Verhalten als Reaktion auf mechanische Verformung hinweist. Jüngste Studien zeigten die Rolle der EZM-Viskoelastizität bei der Zellproliferation, Morphologie und Differenzierung29,30. Diese Studie zeigt Lungen-dECM-Hydrogele als stressentspannende Materialien, ähnlich wie natives Fibrin, Kollagen oder rekonstituierte Basalmembran. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, dass sich aus der Triton-X-100-Methode gewonnene dECM-Hydrogele schneller erholen als aus dem Gefriertauen gewonnene Hydrogele. Daher hat die Wahl der Dezellularisierungsmethode einen großen Einfluss auf die Kriechreaktion und die Relaxationskinetik der resultierenden dECM-Gele.
Die hier beschriebenen Dezellularisierungsmethoden verwenden die Rinderlunge, um die biochemischen und mechanischen Eigenschaften der Lungengewebe-EZM zu rekonstruieren. Wir haben die biochemische und physikalische Zusammensetzung der EZM nach dem Dezellularisierungsprozess fein charakterisiert. Eine große Herausforderung bei Dezellularisierungsmethoden ist die Beibehaltung der EZM-Zusammensetzung, die sich direkt auf die Gelierungsfähigkeit von dECM-Hydrogelen zwischen den Chargen auswirkt. Die Verwendung von Lungengewebe desselben Spenders ist ein wichtiger Parameter, um die Variabilität von Charge zu Charge zu überwinden. Obwohl gesundes natives Gewebe verwendet wurde, ist eine Variabilität zwischen den Spendern unvermeidlich. Insgesamt zeigen sowohl die Freeze-Thaw- als auch die Triton-X-100-Methode ein vielversprechendes Potenzial für den Einsatz nativer dECM-Hydrogele bei der Krankheitsmodellierung der Lunge.
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Disclosures
Alle Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Wissenschaftlichen und Technologischen Forschungsrat der Türkei (TÜBİTAK) finanziert (Fördernummer 118C238). Die gesamte Verantwortung für die Publikation/das Papier liegt beim Eigentümer der Publikation. Die von TÜBİTAK erhaltene finanzielle Unterstützung bedeutet nicht, dass der Inhalt der Veröffentlichung von TÜBİTAK im wissenschaftlichen Sinne genehmigt wird. Die Autoren danken für die Nutzung der Dienste und Einrichtungen des Koç University Research Center for Translational Medicine (KUTTAM). Abbildung 1 und Abbildung 2a wurden mit Biorender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | ISOLAB | 64-17-5 | |
| Acetic acid | ISOLAB | 64-19-7 | |
| Alcian blue solution | Sigma-Aldrich | B8438 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Discovery HR-2 rheometer | TA Instruments | ||
| Entellan mounting medium | Merck | 107960 | |
| Eosin solution | Bright-slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50-980-485 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| Iodine | Sigma-Aldrich | 3002 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Mayer's haematoxylin staining solution | Merck | 2.BS01-103-1000 | |
| O.C.T compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biowest | L0018-100 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| Picric acid | Polysciences | 88-89-1 | |
| Sirius Red | Polysciences | 09400-25 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Triton-X-100 | Merck | 112298 |
References
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