Placcatura RNAi per alimentazione C. elegans: una tecnica per indurre l'espressione di dsRNA bersaglio in E. coli

Abstract

Fonte: Kolundzic, E., et al. Applicazione dell’espressione del fattore di trascrizione indotta da RNAi e heat-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in C. elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive i principi alla base del trattamento RNAi in C. elegans e dimostra un protocollo per abbattere il lin-35 in un ceppo di vermi transgenici.

Protocol

Questo protocollo è tratto da Kolundzic, et al, Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans, J. Vis. Exp. (2018). Preparazione della soluzione Piastre NGM-Agar (1 L) Aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone media (ad esempio Bacto-Pe…

Representative Results

Figura 1: Fenotipo Pvul causato da RNAi contro lin-53. (In alto) Immagine DIC dei vermi di progenie F1 di stadio L4/giovani adulti derivati dal controllo o dalle madri trattate con lin-53 RNAi. Barre di scala = 20 μm. (in basso) Gli animali trattati con lin-53 RNAi mostrano il fenotipo vulva sporgente (pvul) (teste di freccia nere). Il fenotipo pvul conferma che RNAi c…

Materials

Chemicals
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Peptone Media
Yeast extract	AppliChem	A1552,0100
Amphotericin B	USBiological	A2220
CaCl2	Merck Biosciences	208290
Cholesterol	Roth	8866.2
Gelatine	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25,163,364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillin	Roth	634412
Tetracycline	Roth	2371.2
Incubators
Incubator	Sanyo MIR-5	5534210	for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
Microscopes
Stereomicroscope	SMZ745	Nikon
Bacterial strains
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotroph E. coli strain
Worm strains
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
RNAi Clones
lin-53	SourceBioscience	ID I-4D14	Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
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