Summary
本プロトコルは、Illuminaベースの16S rRNA遺伝子配列決定を使用して腸内細菌叢を分析する方法を説明し、ハーブ煎じ薬の有効性を評価するためのフレームワークを提供します。
Abstract
ラットの胃炎および腸内細菌叢に対する Desmodium caudatum の影響を予備的に調査するために、古典的なサリチル酸ナトリウム法を使用して慢性胃炎ラットモデルが確立されました。18匹のSPFラットを、対照群(C群)、モデル群(M群)、治療群(T群)の3群に分けた。胃壁の病理学的切片は、各グループのラットから採取されました。さらに、各群のラットの血清中のガストリンおよびマロンジアルデヒドの濃度をELISAにより測定した。さらに、胃炎のラットの腸内細菌叢に対する D. caudatum の影響は、Illuminaベースの16S rRNA遺伝子配列決定を用いて、3つのグループの腸内細菌群集の詳細な比較を通じて調査されました。結果は、 D. caudatum 煎じ薬がマロンジアルデヒド含有量を減少させ、ガストリン含有量を増加させる可能性があることを示しました。さらに、 D. caudatum 煎じ薬は、腸内細菌叢の多様性と豊富さを高め、腸内細菌叢を調節および回復させることにより、胃炎の治療にプラスの影響を与えることがわかっています。
Introduction
最も一般的な臨床疾患の1つである慢性胃炎(CG)は、胃粘膜上皮の慢性的かつ持続的な炎症性変化を特徴とし、さまざまな病原性因子によって頻繁かつ繰り返し攻撃されます1。胃疾患の罹患率は胃疾患の中で第1位であり、消化器内科2の外来受診率の40%から60%を占めています。さらに、発生率は一般的に年齢とともに増加し、特に中高年の個人では3。間違いなく、CGは人々の生活の質を著しく低下させ、新しい治療薬を発見する必要性を強調しています。
CGの発生と発症は、ガストリン(GAS)などの消化管ホルモンの分泌に関連していることが多くの研究で報告されています4,5。消化管によく見られる消化管ペプチドホルモンであるガスは、好酸球からのヒスタミンの放出を促進することにより、細胞を刺激して胃酸を分泌させます。さらに、胃粘膜の栄養と血液供給を改善し、胃粘膜と頭頂細胞の増殖を促進します6。したがって、ガストリンはCGの発達レベルを評価する指標として利用することができます。さらに、反応性酸化物によって引き起こされる脂質過酸化生成物は、炎症細胞を活性化し、CGにつながる可能性があります。脂質過酸化マーカーであるマロンジアルデヒド(MDA)は、酸化ストレスの程度を測定するために一般的に使用される指標です。これは、胃粘膜内のフリーラジカルのレベルをある程度反映しています。MDAレベルは、フリーラジカルによって引き起こされる局所胃粘膜の不飽和脂肪酸の攻撃を示すことができます7,8。
腸内微生物生態学は、宿主の腸内に生息する何百万もの微生物で構成されており、宿主の健康を維持し、宿主の免疫を調節する上で重要な役割を果たしています。健康な腸内細菌叢は、高い豊かさ、多様性、安定した微生物叢機能を特徴とし、代謝に関与することにより、病原微生物の侵入に対する防御バリアとして機能します。腸内細菌叢の乱れは、個人を急性および慢性の胃腸疾患にかかりやすくします9,10。近年、消化器疾患に対する微生物叢療法が急速に進歩し、有意な有効性が実証されています11。要約すると、腸内細菌叢の考慮は、胃腸疾患を理解し、対処する上で非常に重要です。
民間薬品は、漢方薬の宝庫に欠かせない要素として、臨床と国民医療の近代化にとって大きな意味を持っています。Desmodium caudatum (Thunb.)の根と全体の部分。DC.は、綿陽市の北川強地区で胃の不快感を和らげるために長期間広く使用されています。いくつかの論文は、止血、抗酸化、胃腸保護などの効果を挙げて、D. caudatumによる胃腸疾患の治療の科学的根拠を示しています12,13,14。ただし、詳細な研究が不足しているため、臨床薬力学メカニズムは確立されていません。この記事は、胃腸ホルモンと腸内細菌叢に基づいて胃炎の治療におけるD.caudatumの効果を研究し、その合理的な臨床応用の基礎を提供することを目的としています。
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Protocol
動物の世話と使用の手順は綿陽師範大学の倫理委員会によって承認され、動物の倫理的使用に関するすべての関連する機関および政府の規制が厳格に守られました。本研究では、SPFラット(昆明種、雄、雌、体重180-220g)を利用した。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。すべての動物は病原体のない環境で飼育され、食物への 自由アクセス が提供されました。
1. 試薬の調製
- 電子スケールで2.5gのサリチル酸ナトリウム粉末( 材料表を参照)を秤量して、5%サリチル酸ナトリウム溶液を調製します。粉末を少量の蒸留水に溶かし、総量50mLに希釈します。
- D. caudatum(12.8 g / kg)の煎じ薬を準備します。128 gのD.caudatum(材料表を参照)を秤量し、1000 mLの実験室用蒸留水を含む丸底フラスコに入れ、最終容量100 mLになるまで濃縮します。
2. グループ化と管理
- ラットを異なるグループに分け、必要な溶液を胃内投与します。
注:本研究では、18匹のラット(雄9匹、雌9匹)を対照群(グループC)、モデル群(グループM)、治療群(グループT)の3つのグループに分け、各グループに6匹のラットを配置しました。対照群は生理食塩水を投与され、モデル群は5%サリチル酸ナトリウム溶液を10 mL / kg /日の用量で5週間投与された15。治療群は、5%サリチル酸ナトリウム溶液で10 mL / kg /日の用量で5週間前処理され、続いて1 mL / 100 gの用量でD.caudatum煎じ薬を10日間投与されました15,16。 - 実験最終日にテールキャリー法17 を用いて、乾燥・滅菌の微量遠心チューブにラットの糞便を採取し、液体窒素超低温冷凍庫で凍結する。
- サンプリング終了後、子宮頸部脱臼によってラットを犠牲にします(施設で承認されたプロトコルに従います)。ハサミで腹腔を開き、腹部大動脈を露出させます。
- 針(23〜25 G)を腹部大動脈にほぼ平行に挿入し、血清を採取し、超低温冷凍庫で保存します。腹腔16 から胃を取り出し、保存のために10%ホルマリン溶液に浸します。
注:グループMでは、胃粘膜が拡張し、通常の腺形態でうっ血している場合、慢性胃炎モデルは成功したと見なされます15。
- 針(23〜25 G)を腹部大動脈にほぼ平行に挿入し、血清を採取し、超低温冷凍庫で保存します。腹腔16 から胃を取り出し、保存のために10%ホルマリン溶液に浸します。
3.胃壁の病理学的切片
- 病理切片の各グループのラットから胃壁サンプルを採取します。続いて、定期的なヘマトキシリン-エオシン染色を行い、病理学的変化を観察および分析します18。
4.血清胃腸ホルモンの測定
- 血清サンプル中のガストリン(GAS)およびマロンジアルデヒド(MDA)19 の含有量を、メーカーの指示に従ってELISAを用いて検出します( 材料表を参照)。分析にはマイクロプレートリーダーを利用します。
5. 糞便の総DNAの抽出およびPCRの拡大および浄化
- 市販のDNA単離キット( 材料表参照)を用いて微生物DNA抽出を行い、UV-Vis分光光度計16を用いて濃度および純度を決定する。続いて、1%アガロースゲル電気泳動18でDNAの完全性を評価します。
- サーモサイクラーPCRシステムを用いて、プライマー338F(5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3')および806R(5'-GAC TAC HVG GGG GTW TCT AT-3')で細菌の16S rRNA遺伝子を増幅する17。プライマーは市販の供給源から入手した( 材料表を参照)。
注:PCRプログラムに従ってください:変性(3分、95°C)、続いて27サイクル(30秒、95°C、30秒、55°C、45秒、72°C)、および最終伸長(10分、72°C)。4 μL の 5× DNA ポリメラーゼバッファー、2 μL の 2.5 mM dNTP、各プライマー 0.8 μL(5 μM)、0.4 μL の DNA ポリメラーゼ、10 ng のテンプレート DNA (材料表を参照) で PCR 反応を行います( 材料表を参照)。 - 2%アガロースゲル、市販のDNAゲル抽出キット、および蛍光光度計をそれぞれ使用して、PCR産物を順次抽出、精製、および定量します17。
6. シーケンシング
注:ステップ6およびステップ7は、以前に公開された方法20、21に従って実行されます。
- シーケンシングにはIlluminaプラットフォームを利用します。
注:DNA断片の一端は、チップに埋め込まれたコネクタのベースを補完し、チップに固定します。もう一方の端は、隣接する別の埋もれた接合部の基部をランダムに補完し、「ブリッジ」を形成します。 - PCR増幅を行い、DNAクラスターを作製します。DNA増幅器を一本鎖に線形化します。
- 4つの異なる蛍光マーカーを特徴とするデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)とともに、改変されたDNAポリメラーゼを導入します。1サイクルにつき1つの塩基のみを合成します。
- レーザーを利用して反応プレートの表面をスキャンし、各テンプレート配列の初期反応中に重合したヌクレオチドの種類を決定します。
- 「蛍光基」と「終端基」を化学的に切断し、3'粘着末端を再確立します。続いて、第2ヌクレオチドの重合に進む。
- 各ラウンドで収集した蛍光シグナルの結果を解析することにより、テンプレートDNA断片の配列を取得します。
7. シークエンスデータの処理
- 最初に、スコアが Q20 <任意のサイトで生の fastq データのリードをトリミングし、不確実なベースを持つリードを排除します。さらに、正確にマッチしたプライマーで2つのミスマッチを許容します。続いて、配列をオーバーラップ>10 bpでマージします。
- UPARSEを使用して97%の類似性を持つ運用分類単位(OTU)をクラスタリングし、UCHIME20,21でキメラ配列を削除します。
- RDP 分類器アルゴリズムを使用して、信頼度しきい値 70% を使用して、各 16S rRNA 遺伝子配列の分類を Silva (SSU123) 16S rRNA データベースに対して分析します。
- Mothur と Qiime を使用して、それぞれ Alpha 多様性解析とベータ多様性解析を実行します ( 材料表を参照)。
8. 統計解析
- この研究のデータは、統計解析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して分析します。複数のグループ間の比較には一元配置分散分析(ANOVA)を使用し、2つのグループ間の比較には最小有意差(LSD)検定を利用します。
- すべての比較で P <0.05を統計的に有意であると考えてください。 P < 0.01 は極めて有意である。
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Representative Results
胃壁の病理学的切片の結果を 図1に示します。グループCと比較して、グループMは軽度の胃壁萎縮と軽度の炎症を示しました。しかし、グループMと比較すると、グループTは明らかな炎症、腸上皮化生、または萎縮を示さなかった。これは、 D. caudatum 煎じ薬が胃炎を効果的に改善できることを示唆しています。
血清消化管ホルモンアッセイの結果を 図2に示します。マロンジアルデヒド(MDA)の含有量は、グループCよりもグループMで有意に高かった。 D. caudatum 煎じ薬で処理した後、それは有意に減少しました。ガストリン(GAS)の含有量については、グループMはグループCよりも有意に低いレベルを示しましたが、グループTは有意な増加を示しました。これらの結果は、 D. caudatum 煎じ薬が胃炎を治療するための消化管ホルモンのレベルを調節する可能性があることを示しています。
表1と図3に示すように、アルファダイバーシティ分析では、グループMとグループTのコミュニティの間に有意差があることが明らかになりました。C群とT群の細菌数はM群よりも多く、ラットの腸内細菌の数と種類は、治療後に徐々に正常レベルになる傾向があることが示唆されます。
種組成分析
図4Aによると、群集棒グラフは、乳酸桿菌とnorank_f__MuribaculaceaeがグループCで最大の割合を占めており、グループMにはClostridium_sensu_stricto_1とヘリコバクターが豊富に含まれていることを示しています。グループTのコミュニティ構成はグループCのそれとより似ており、重要な構成要素は乳酸桿菌とロンブーツィアです。さらに、スピアマン相関ヒートマップ(図4B)とサーコス図(図4C)を組み合わせると、グループCとグループMの間で植物相構成に大きな違いがあり、優勢な植物相に明確な違いがあることがわかります。治療後、グループTは正常な細菌叢の状態に戻る傾向があります。さらに、図5は、M群とC群の群集構成に極端な違いがあり、胃炎ラットの腸内細菌叢の構造と組成に有意な変化が生じていることを示しています。治療後、グループCとグループTの間には細菌叢組成に類似点があり、グループTとグループMの間にはいくつかの類似点があります。これらの結果は、D. caudatum 煎じ薬が胃炎ラットの腸内細菌叢を正常または正常に近い状態に回復させる可能性があることを示しています。
種差分析
図6Aの多種比較列グラフから、グループCではNorank_f_Muribaculaceaeが豊富で、グループMおよびグループTとは大きく異なることがわかります。治療後、グループTのNorank_f_Muribaculaceae数は増加傾向を示しています。また、M群に多く存在するClostridium_sensu_stricto_1は、過酷な環境下でも弾力性を発揮します。治療後、その数は有意に減少し、D. caudatum decoctionは腸内細菌叢の生存環境をある程度改善することが示唆された。一方、図6BのLEfSeマルチレベル種階層ツリー分析では、グループ間で有意な差がある44種が示されています。Norank_f_muribaculaceae、Clostridium_sensu_stricto_1、ロンブーツィアは、それぞれグループC、グループM、グループTに豊富であることがわかりました。
図1:胃壁の病理切片の結果。 (A)グループCの胃の病理学的切片。 (B)グループMの胃の病理学的切片。 (C)グループTの胃の病理学的切片。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:血清消化管ホルモンの内容物。 (A)MDA(マロンジアルデヒド)測定結果のバー分析チャート。(B)ガス測定結果の棒グラフ。*P < 0.05、**P < 0.01。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:多様性指数Tのカラムグラム。 赤のバーはグループC、青はグループT、緑はグループM.*P <0.05、**P <0.01を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:群集構成分析。 (A)コミュニティヒストグラム分析。(B)属レベルでのコミュニティヒートマップ分析。(C)試料と種の関係をサーコス図で分析。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:属レベルでのPLS-DA分析。 赤はグループC、青はグループT、緑はグループMを表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:種差分析。 (A) Kruskal-Wallis H検定棒グラフ。(B) LefSe多層種の樹形図。赤はグループC、青はグループT、緑はグループMを表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 群 | 平均値 | 標準偏差 |
| C | 3.5201 | 0.63641 |
| M | 3.2755 | 0.28494 |
| T | 3.5388 | 0.29945 |
表1:アルファダイバーシティ指数の結果。
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Discussion
D. caudatumは、Qiang nationality12で一般的に使用されている民間療法であり、胃腸疾患の治療に大きな有効性を示しています。現代の薬理学的研究の進歩に伴い、胃腸の微小生態学の不均衡に起因する細菌叢の不均衡は、急性および慢性の胃腸疾患の重要な要因として特定されています22,23。腸管内の特定の微生物は、体内の動的バランスを維持する上で重要な役割を果たし、血清中のホルモンは体の生理学的および病理学的状態を反映しています。したがって、この研究は腸内細菌叢と消化管ホルモンに焦点を当てています。
16S rRNAハイスループット遺伝子シーケンシングは、腸内微生物を検出するための主要な方法です。採取した検体中の微生物の種類や機能を検出することができ、腸内微生物の種類ごとに正確かつ定量的な分析が可能です。近年、16S rRNAハイスループット遺伝子シーケンシングは急速に発展し、さまざまな生態環境における微生物多様性解析に広く使用されています24,25,26。
胃炎ラットの腸内細菌叢に対するD. caudatumの影響は、Illuminaベースの16S rRNA遺伝子配列決定に基づく3つのグループの腸内細菌群集の詳細な比較を通じて調査されました。現代の科学的研究によると、乳酸菌、norank_f__Muribaculaceae、ロンブーツィア、ビフィズス菌はプロバイオティクスであり、それぞれに複数の悪性腫瘍のリスクの軽減、抗炎症作用のあるビタミンKの生成、多糖類代謝の促進、下痢や便秘の改善などの特定の健康上の利点があります27,28,29.腸管損傷における病原性細菌であるClostridium_sensu_stricto_1は、炎症や菌血症を引き起こす可能性があり、血液や消化管腫瘍と密接に関連しています30。慢性胃炎および萎縮性胃炎は、胃腫瘍に大きく寄与する31。
ベータ分析では、治療後の乳酸桿菌、norank_f__Muribaculaceae、ロンブーチア、ビフィズス菌、およびClostridium_sensu_stricto_1の内容に有意な変化が見られます。乳酸菌、norank_f__Muribaculaceae、ロンブーツィアの含有量は有意に増加したが、ビフィズス菌とClostridium_sensu_stricto_1は、 D. caudatum 処理後に有意に減少した。さらに、コミュニティ棒グラフは、グループTのコミュニティ構成がグループCのコミュニティ構成に類似していることを示唆しています。これらの結果は、 D. caudatum がラットの胃炎の有病率を改善する可能性があることを示しています。しかし、 D. caudatum によるプロバイオティクスビフィズス菌の含有量減少の背後にある特定のメカニズムについては、さらなる研究が必要です。
ELISAキット法は、高感度、強い特異性、操作の容易さ、および小さなサンプルサイズへの適合性を備えています32。本研究では、ラット血清中のマロンジアルデヒド(MDA)とガストリン(GAS)の含有量を検出するために利用しました。MDAは脂質過酸化の程度を反映し、間接的に細胞損傷の程度を示します。胃炎のラットでは、MDAレベルは正常ラットよりも有意に高く、胃頭頂細胞の損傷を示唆しています。 D. caudatum の治療はMDAレベルを有意に低下させ、胃炎の治療における可能性を示しました。逆に、 D. caudatum は減少したGASレベルを増加させ、胃炎の修復または治療に寄与しました。
しかし、16S rRNAのハイスループット遺伝子シーケンシングとELISAキット法の両方に限界があります。16S rRNAのハイスループット遺伝子シーケンシングでは、分解能が低いと、配列が類似性の高い株や属を区別することが困難になり、属、科、門などのより高い分類レベルでの分類が困難になる場合があります33。ELISAキット法では、通常、希釈や洗浄などのサンプル前処理ステップが必要であり、潜在的な誤差やばらつきが生じます34。
今回の研究は、 D. caudatum が消化管ホルモンと腸内細菌叢を調節することで胃炎を治療する可能性を示唆しており、その幅広い臨床応用に関する手掛かりを与えている。しかし、今後の研究では、他の消化器ホルモン、腸内細菌叢を調節するメカニズム、および関連する効果的な化学物質を掘り下げる必要があります。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、四川省科学技術局の重点研究開発プロジェクト(2020YFS0539)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alpha diversity analysis | Mothur 1.30.2 | ||
| AxyPrep deoxyribonucleic acid (DNA) gel extraction kit | Axygen Biosciences | AP-GX-50 | |
| Beta diversity analysis | Qiime 1.9.1 | ||
| Cryogenic refrigerator | Forma-86C ULT freezer | ||
| Desmodium caudatum | The Traditional Chinese Medicine Hospital of Beichuan Qiang Autonomous County | ||
| E.Z.N.A. soil kit | Omega Bio-tek | D5625-01 | |
| Illumina MiSeq Platform | Illumina Miseq PE300/NovaSeq PE250 | ||
| Multiskan Spectrum | spectraMax i3 | ||
| OTU clustering | Uparse 7.0.1090 | ||
| OTU statistics | Usearch 7.0 | ||
| PCR instrument | TransGen AP221-02 | ||
| PCR instrument | ABI GeneAmp 9700 | ||
| QuantiFluor-ST double-stranded DNA (dsDNA) system | Promega Corp. | ||
| Sequence classification annotation | RDP Classifier 2.11 | ||
| Sodium salicylate | Sichuan Xilong Chemical Co., Ltd | 54-21-7 | |
| SPF rats | Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd | ||
| SPSS 18.0 | IBM |
References
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