Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66627
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Groningen

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים אחרים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר ומיקרומטר.

Abstract

אנו מציגים שיטה לשלב בשלפוחיות רשתות חלבונים מורכבות, המערבות חלבוני ממברנה אינטגרליים, אנזימים וחיישנים מבוססי פלואורסצנטיות, תוך שימוש ברכיבים מטוהרים. שיטה זו רלוונטית לתכנון ובנייה של ביוריאקטורים ולחקר רשתות תגובה מטבולית מורכבות מחוץ לשיווי משקל. אנו מתחילים בבנייה מחדש של חלבוני ממברנה (מרובים) לשלפוחיות חד-למלריות גדולות (LUVs) על פי פרוטוקול שפותח בעבר. לאחר מכן אנו עוטפים תערובת של אנזימים מטוהרים, מטבוליטים וחיישנים מבוססי פלואורסצנטיות (חלבונים פלואורסצנטיים או צבעים) באמצעות הקפאה-הפשרה-אקסטרוזיה ומסירים רכיבים שאינם משולבים באמצעות צנטריפוגה ו/או כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. ביצועי הרשתות המטבוליות נמדדים בזמן אמת על ידי ניטור יחס ATP/ADP, ריכוז מטבוליטים, pH פנימי או פרמטרים אחרים על ידי קריאת פלואורסצנטיות. ניתן להמיר את השלפוחיות המכילות חלבון ממברנה בקוטר 100-400 ננומטר לשלפוחיות ענקיות (GUV), באמצעות הליכים קיימים אך מותאמים. הגישה מאפשרת הכללת רכיבים מסיסים (אנזימים, מטבוליטים, חיישנים) בשלפוחיות בגודל מיקרומטרי, ובכך להגדיל את נפח הביוריאקטורים בסדרי גודל. הרשת המטבולית המכילה GUV לכודים בהתקנים מיקרופלואידים לניתוח במיקרוסקופ אופטי.

Introduction

תחום הביולוגיה הסינתטית מלמטה למעלה מתמקד בבניית תאים (מינימליים) 1,2 וביוריאקטורים מטבוליים למטרות ביוטכנולוגיות 3,4 או ביו-רפואיות 5,6,7,8. בניית תאים סינתטיים מספקת פלטפורמה ייחודית המאפשרת לחוקרים לחקור חלבונים (ממברנה) בתנאים מוגדרים היטב המחקים את אלה של סביבות טבעיות, ומאפשרת גילוי תכונות מתפתחות ופונקציות ביוכימיות נסתרות של חלבונים ורשתות תגובה9. כצעד ביניים לקראת תא סינתטי המתפקד באופן אוטונומי, מפותחים מודולים הלוכדים תכונות חיוניות של תאים חיים כגון שימור אנרגיה מטבולית, סינתזת חלבונים ושומנים, והומאוסטזיס. מודולים כאלה לא רק לשפר את ההבנה שלנו של החיים, אלא גם יש יישומים פוטנציאליים בתחומי רפואה8 וביוטכנולוגיה10.

חלבונים טרנסממברנליים נמצאים בלב כמעט כל רשת מטבולית מכיוון שהם מעבירים מולקולות לתוך התא או החוצה ממנו, מאותתים ומגיבים לאיכות הסביבה, וממלאים תפקידים ביוסינתטיים רבים. לפיכך, הנדסה של מודולים מטבוליים בתאים סינתטיים דורשת ברוב המקרים הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה אינטגרליים ו / או היקפיים לתוך דו-שכבה קרום המורכבת מליפידים ספציפיים ושלמות גבוהה (חדירות נמוכה). הטיפול בחלבוני ממברנה אלה מאתגר ודורש ידע ספציפי ומיומנויות ניסוייות.

מספר שיטות פותחו כדי לשחזר חלבוני ממברנה בתוך שלפוחיות פוספוליפידים, לרוב במטרה לחקור את הפונקציה11,12, תקנה13, תכונות קינטיות14,15, תלות שומנים15,16, ו / או יציבות17 של חלבון מסוים. שיטות אלה כוללות דילול מהיר של חלבון המסיס בדטרגנטים למצע מימי בנוכחות ליפידים18, סילוק דטרגנטים על ידי דגירה של חלבון מסיס בדטרגנטים עם בועיות שומנים מעורערות דטרגנטים וספיגת הדטרגנטים על חרוזי פוליסטירן19, או הסרת דטרגנטים על ידי דיאליזה או כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל20. ממיסים אורגניים שימשו ליצירת בועיות שומנים, למשל, באמצעות היווצרות שלבי שמן-מים21, אך רוב חלבוני הממברנה האינטגרלית מושבתים כאשר הם נחשפים לממיסים כאלה.

במעבדה שלנו, אנו בעיקר משחזרים חלבוני ממברנה בשיטת ספיגת חומרי ניקוי ליצירת שלפוחיות חד-למלריות גדולות (LUVs)19. שיטה זו מאפשרת הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה מרובים ואת האנקפסולציה בלומן השלפוחית של אנזימים, מטבוליטים ובדיקות22,23. ניתן להמיר את ה-LUV המכילים חלבון ממברנה לשלפוחיות ענקיות-חד-לאומיות (GUVs) עם/בלי אנקפסולציה של רכיבים מסיסים במים, באמצעות אלקטרופורמציה24 או נפיחות25 בסיוע ג'ל ותנאים ספציפיים לשמירה על שלמות חלבוני הממברנה26.

מאמר זה מציג פרוטוקול להרכבה מחדש ב-LUV של רשת מטבולית מחוץ לשיווי משקל המחדשת ATP באמצעות פירוק L-ארגינין ל-L-אורניתין27. היווצרות ATP קשורה לייצור גליצרול-3-פוספט (G3P), אבן בניין חשובה לסינתזה של פוספוליפידים22,28. המסלול המטבולי מורכב משני חלבוני ממברנה אינטגרליים, ארגינין/אורניתין (ArcD) ואנטיפורטר G3P/Pi (GlpT). נוסף על כך, שלושה אנזימים מסיסים (ArcA, ArcB, ArcC) נדרשים למחזור ATP, ו-GlpK משמש להמרת גליצרול לגליצרול 3-פוספט, באמצעות ATP מפירוק L-ארגינין, ראו איור 1 לסקירה סכמטית של המסלול. פרוטוקול זה מייצג נקודת התחלה טובה לבנייה עתידית של רשתות תגובה מורכבות עוד יותר - לסינתזה של שומנים או חלבונים או לחלוקת תאים. הרכב השומנים של השלפוחיות תומך בפעילות של מגוון רחב של חלבוני ממברנה אינטגרליים והותאם להובלת מולקולות מגוונות לתוך או מחוץ לשלפוחיות 27,29,30.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של המסלול לייצור ATP ולסינתזה והפרשה של גליצרול 3-פוספט. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בקיצור, חלבוני ממברנה מטוהרים (מסיסים בדודציל-β-D-מלטוזיד, DDM) מתווספים לבועיות שומנים מוכנות מראש שהתערערו עם טריטון X-100, המאפשר החדרת החלבונים לממברנה. מולקולות הדטרגנט מוסרות לאחר מכן (לאט) על ידי תוספת של חרוזי פוליסטירן פעילים, וכתוצאה מכך נוצרות פרוטאוליפוזומים אטומים היטב. לאחר מכן ניתן להוסיף רכיבים מסיסים לשלפוחיות ולעטוף אותם באמצעות מחזורי הקפאה-הפשרה, אשר לוכדים את המולקולות בתהליך של איחוי ממברנה. השלפוחיות המתקבלות הטרוגניות מאוד ורבות מהן מולטילמלריות. לאחר מכן הם מושחלים דרך מסנן פוליקרבונט עם גודל נקבוביות של 400, 200 או 100 ננומטר, אשר מניב שלפוחיות בגודל אחיד יותר; ככל שהנקבוביות קטנות יותר, כך השלפוחיות הומוגניות וחד-לאומיות יותר, אך במחיר של נפח פנימי קטן יותר. חלבונים שאינם מאוגדים ומולקולות קטנות מוסרים מהתמיסה החיצונית על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. ניתן להמיר את ה-proteoLUVs לבועיות בגודל מיקרומטר על ידי נפיחות בעזרת ג'ל, ו-proteoGUV אלה נאספים ונלכדים בשבב מיקרופלואידי לצורך אפיון מיקרוסקופי ומניפולציה. איור 2 מציג סקירה סכמטית של הפרוטוקול המלא.

Figure 2
איור 2: סקירה כללית של פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר (LUV) ומיקרומטר (GUV). לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקולי ההרכבה מחדש והאנקפסולציה עובדים היטב והפונקציונליות של החלבונים נשמרת, אך הפרוטיאו-לובים והפרוטאוגו-גובים הם הטרוגניים בגודלם. גישות מיקרופלואידיות31,32 מאפשרות היווצרות שלפוחיות בגודל מיקרומטרי שהן הומוגניות יותר בגודלן, אך הרכבה מחדש פונקציונלית של חלבוני ממברנה אינה אפשרית בדרך כלל מכיוון שממס שיורי בדו-שכבה משבית את החלבונים. גודלם של הפרוטאולובים נע בין 100 ל-400 ננומטר, ובריכוזים נמוכים של אנזימים, האנקפסולציה עלולה להוביל לבועיות עם מסלולים מטבוליים לא שלמים (השפעות סטוכסטיות; ראו איור 3). LUVs אידיאליים לבניית מודולים מטבוליים ספציפיים, כפי שמוצג כאן לייצור ATP ואבני בניין כמו G3P. proteoLUVs כאלה יכולים להיות עטופים באופן פוטנציאלי ב- GUV ולשמש כתאים דמויי אברונים עבור שלפוחיות המאכסן.

Figure 3
איור 3: מספר המולקולות לשלפוחית בקוטר של 100, 200 או 400 ננומטר. (A) כאשר החלבונים העטוף (אנזימים, גשושיות) נמצאים בטווח של 1-10 מיקרומטר. (B) הבנייה מחדש נעשית ב-1 עד 1,000, 1 עד 10,000, ו-1 עד 100,000 חלבוני ממברנה לכל ליפיד (mol/mol). אנו יוצאים מנקודת הנחה שהמולקולות עטופות בריכוזים שצוינו ומשולבות בממברנה ביחסי חלבון-שומנים אלה. עבור אנזימים מסוימים, ראינו כי הם נקשרים לממברנות, אשר יכול להגדיל את הריכוז לכאורה שלהם שלפוחיות. קיצור: LPR = יחס שומנים-חלבונים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה כללית

  1. כימיקלים
    1. יש להמיס שומנים (בצורת אבקה) ל-25 מ"ג/מ"ל ב-CHCl3 להכנת ליפוזומים מוכנים.
      הערה: עדיף להכין מלאי שומנים טריים, אך ניתן לאחסן את תמיסות המלאי גם ב -20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. עבודה עם שומנים בצורת אבקה מדויקת יותר מאשר שימוש בליפידים שכבר מסיסים ב-CHCl3. CHCl3 צריך להיות מטופל באמצעות פיפטות זכוכית ו / או מזרקים ולאחסן במיכלי זכוכית כמו CHCl3 ממיס פלסטיק.
    2. המסת מולקולות קטנות (נוקלאוטידים, חומצות אמינו, בדיקות פלואורסצנטיות) עבור הליך האנקפסולציה ב- 50 mM KPi (חיץ A, ראה טבלה 1) והתאמת ה- pH ל- 7.00 ±- 0.01. יש להמיס את MgCl2 במים שעברו דה-יוניזציה כדי למנוע היווצרות של משקעים של מגנזיום פוספט.
      הערה: ניתן לאחסן תמיסות מלאי בטמפרטורה של -20°C למשך מספר שבועות, למעט DTT, אשר מוכן טרי ביום הניסוי.
    3. להמיס יונופורים (למשל, valinomycin, nigericin) ב-DMSO או ב-EtOH בריכוז מלאי של 100-500 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך מספר שבועות; יש להימנע מאידוי.
      הערה: DMSO אינו תנודתי ולכן עדיף על EtOH. השתמש זכוכית במקום בקבוקוני פלסטיק כדי למנוע הידבקות של ionophores על פני השטח של הבקבוקונים.
  2. מאגרי
    1. הכינו מאגרים טריים ביום הניסוי (טבלה 1). אין לאחסן למשך יותר מ-24 שעות.
  3. טיהור חלבונים מסיסים
    1. Express ArcA, ArcB, ArcC (אנו משתמשים בגרסה ספציפית בשם ArcC1), PercevalHR ו-GlpK כפי שתואר קודם לכן 27,28,33. הקפד להוסיף 10% v/v גליצרול למאגר הליזה של התא, אשר משפר את יציבות החלבונים. לטהר את החלבונים המסיסים כמתואר 27,28,33 וכפי שידווח להלן זמן קצר לאחר מכן.
    2. הפשיר 10 מ"ל ליזט תאים (~ 5 גרם משקל רטוב) באמבט מי קרח. בינתיים, יש למרוח 2 מ"ל (1 CV) Ni2+-Sepharose שרף על עמוד זרימת כבידה (קיבולת 20 מ"ל) עם מים נטולי יונים, (12 CVs) וחיץ B (4 CVs) לשטיפה. מעבירים את הליזט המופשר לקרח; עבודה על קרח, אלא אם כן צוין אחרת.
    3. מוסיפים אימידזול לריכוז סופי של 10 mM לליזט המופשר, ואז יוצקים את התמיסה על עמוד זרימת הכבידה. יש לדגור במשך שעה אחת ב-4°C עם אגוז עדין.
    4. לאחר שעה, יש להשליך את הזרימה ולשטוף את השרף עם Buffer C (20 קורות חיים).
    5. הקלו את החלבון עם Buffer D. השתמשו ב-60% CV לשלב ה-elution הראשון, ואחריו 4-6 שלבים של 40% CVs.
    6. לקבוע את ריכוז החלבון ולהוסיף Na-EDTA לריכוז סופי של 5 mM.
    7. סובבו את החלבון המטוהר בצנטריפוגה שולחנית מקוררת (מהירות מרבית, 10 דקות, 4°C). לטהר על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל באמצעות Buffer E. אסוף יחד את שברי האלוציה ורכז אותם ל~ 10 מ"ג / מ"ל עם מסנן ריכוז עם חתך של 30 kDa. הכינו aliquots בגודל המתאים (~ 20 μL), להקפיא במהירות הבזק עם חנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 °C לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: חשוב לרכז את האנזימים ל-50-100 מיקרומטר כדי למזער את הנפח הדרוש לכימוס.
  4. טיהור חלבוני ממברנה
    1. Overexpress ArcD ו- GlpT כפי שתוארו קודם לכן 22,27,33. הקפד להוסיף 10% v/v גליצרול למאגר הליזה של התא; לטיהור ArcD, כלול חומר מחזר של 2 mM (לדוגמה, DTT) במאגר. לטהר את החלבונים המתויגים על ידי כרומטוגרפיה Ni2+-Sepharose.
      1. הפשירו אליקוט של בועיות קרום גולמי (10-20 מ"ג של חלבון ממברנה כולל) באמבט מי קרח.
        הערה: לאחר ההפשרה, יש לעבוד תמיד על קרח, אלא אם צוין אחרת. ראה טבלה 1 עבור המאגרים המשמשים בסעיף זה.
      2. הוסף את שלפוחיות הממברנה ל- Buffer F (ArcD) או ל- Buffer G (GlpT) לנפח סופי של 6 מ"ל. לדגור את הדגימה במשך 1 שעה ב 4 ° C עם אגוז עדין.
      3. יש להפריד את חלבוני הממברנה המסיסים מפסולת הממברנה באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (337,000 × גרם, 30 דקות, 4°C). בינתיים, יש למרוח 0.25 מ"ל (1 CV) של שרף Ni2+-Sepharose על עמוד זרימת כבידה (קיבולת של 10 מ"ל) עם מים נטולי יונים, (40 CVs) ו-20 CVs של Buffer H (ArcD) או Buffer I (GlpT).
      4. יוצקים את החלבון המסיס על עמוד זרימת הכבידה ומוסיפים אימידזול לריכוז סופי של 10 מילימול. יש לדגור במשך שעה אחת ב-4°C עם אגוז עדין.
      5. לאחר שעה אחת, השליכו את הזרימה ושטפו את השרף עם 20 קורות חיים של Buffer J (ArcD) או Buffer K (GlpT).
      6. יש להקפיד על חלבון הממברנה בשלבים של 60% CV (1st) ו-40% CV (2 nd-6th) עם Buffer L (ArcD) או Buffer M (GlpT).
      7. קבע את ריכוז החלבון והמשך לסעיף 2.2. לבנייה מחדש של הממברנה.
        הערה: טיהור אי הכללת גודל אינו מבוצע בהכרח עבור חלבוני ממברנה, שכן המבנה מחדש של הממברנה מניב טיהור דומה. שלבים 1.4 ו 2.2 ניתן לבצע ביום אחד של עבודה. התחל עם טיהור חלבון (שלב 1.4) בבוקר והמשך עם reconstitution (שלב 2.2) אחר הצהריים. החוקה מחדש מסתיימת למחרת (ראה סעיף 2.2 לפרטים). נקודת עצירה: ניתן לאחסן ArcD ו-GlpT מטוהרים ומסיסים ב-DDM בטמפרטורה של -80 מעלותצלזיוס לשימוש מאוחר יותר, אך הדבר אינו נכון לגבי כל חלבוני הממברנה. להכין aliquots בגודל המתאים (50-200 μL), להקפיא הבזק עם חנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. חלבונים אלה פעילים במשך מספר חודשים כאשר מאוחסנים ב -80 ° C בנוכחות 10% v/v גליצרול.
  5. הכנת β-קזאין למטרות פסיבציה
    1. להשהות מחדש 100 מ"ג של β-קזאין ב 20 מ"ל של מים deionized ו titrate עם 1 M NaOH עד β קזאין מומס לחלוטין. לאחר מכן, להוסיף 1 M חומצה אצטית כדי להתאים את ה- pH ל 7.0 ולמלא את נפח ל 50 מ"ל עם מים deionized. מסננים את התמיסה דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ועושים aliquots של 500 μL.
      הערה: ניתן לאחסן את β-קזאין בטמפרטורה של -20°C למשך 6 חודשים. מומלץ לסנן שוב את β-קזאין לפני השימוש כדי למנוע מאגרגטים של β קזאין לסתום את השבב המיקרופלואידי.

מאגר הרכב
חיץ א' 50 mM KPi pH 7.0
חיץ B 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v גליצרול, 10 mM imidazole, pH 7.5
חיץ C 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v גליצרול, 50 mM imidazole, pH 7.5
חיץ D 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v גליצרול, 500 mM imidazole, pH 7.5
חיץ E 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v גליצרול, pH 7.0
חיץ F 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0.5% w/v DDM, 10% v/v גליצרול, 2 mM β-מרקפטואתנול, pH 7.5
חיץ G 50 mM Tris-HCl, 0.5% עם DDM, 20% עם גליצרול, pH 8
חיץ H 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0.02% w/v DDM, 10% v/v גליצרול, 2 mM β-מרקפטואתנול, 10 mM אימידזול, pH 7.5
חיץ I 50 mM Tris-HCl, 0.04% עם DDM, 20% v/v גליצרול, 10 mM imidazole, pH 8.0
חיץ J 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0.02% עם V DDM, 10% v/v גליצרול, 2 mM β-מרקפטואתנול, 50 mM אימידזול, pH 7.5
חיץ K 50 mM Tris-HCl, 0.04% עם DDM, 20% v/v גליצרול, 50 mM אימידזול, pH 8
חיץ L 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0.02% w/v DDM, 10% v/v גליצרול, 2 mM β-מרקפטואתנול, 500 mM אימידזול, pH 7.5
חיץ M 50 mM Tris-HCl, 0.04% עם DDM, 20% v/v גליצרול, 500 mM imidazole, pH 8
חיץ N 50 mM KPi, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7.0
חיץ O 50 mM KPi, 0.5 mM L-ornithine, 10 mM Na-ADP, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7.0
חיץ P 50 mM KPi pH 7.0, 2 mM DTT, x mM גלוקוז (x משתנה כדי להתאים את האוסמולריות של המדיום החיצוני והפנימי)
חיץ Q 50 mM KPi pH 7.0, 0.5 mM סוכרוז, 2 mM DTT
חיץ R 50 mM KPi pH 7.0, 2 mM DTT, 10 mM L-arginine, x mM גלוקוז

טבלה 1: מאגרים המשמשים בפרוטוקול זה.

2. פרוטאוליפוזומים: הרכבה מחדש של חלבוני קרום מטוהרים לשלפוחיות שומנים מוכנות

  1. יום 1
    1. הכנת שלפוחיות שומנים מוכנות
      1. בחר את הרכב השומנים (למשל, פוספוליפידים סינתטיים, ליפידים קוטביים E. coli ) על בסיס הדרישות של חלבוני הממברנה.
        הערה: תערובת של DOPE, DOPG ו- DOPC (25:25:50 mol%) היא נקודת התחלה טובה, אך סטרולים או קרדיוליפין עשויים להידרש עבור חלבונים מסוימים; עבור חלבונים בקרום פלזמה שמרים, אנו כוללים שומנים palmitoyl-oleoyl במקום dioleoyl30. תערובת סמים, DOPG ו-DOPC (25:25:50 molp%) מספיקה להרכבה מחדש של ArcD ו-GlpT.
      2. מערבבים את הליפידים הרצויים (מסיסים ב-CHCl3) ומאדים את ה-CHCl3 במאייד סיבובי עד ליצירת שכבת שומנים. לשטוף את השומנים על ידי הוספת אתר diethyl בנפח שווה כמו CHCl3. לאדות את אתר diethyl ולקבל סרט שומנים יבש.
      3. יש להשהות מחדש את שכבת השומנים ל-20 מ"ג/מ"ל מסך השומנים במדיה מימית (Buffer A). התחל עם מחצית מהנפח הכולל ונער בעדינות; לאחר מכן, בזהירות להעביר את השומנים לצינור נקי או בקבוק בגודל הולם. מוסיפים חיץ A טרי לבקבוק וחוזרים על ההליך להמסת השומנים הנותרים והעברתם לכלי חדש. הוסף חיץ A נוסף כדי להגיע לריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל.
      4. סוניק את השומנים המרחפים באמצעות סוניק בדיקה. השתמש בפרמטרים הבאים עבור קצה סוניק בקוטר של 6 מ"מ: עוצמה של 4 מיקרומטר, משרעת של 70%, 5 שניות על, 45 שניות כבויות, 16 מחזורים. טבלו את השומנים באמבט מי קרח המכיל EtOH כדי למנוע התחממות יתר על ידי סוניקציה.
      5. הקפיאו במהירות הבזק את הדגימה הסוניק (נפח של 40 מ"ל בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל) בחנקן נוזלי, והפשירו את הדגימה באמבט מים בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה פעם אחת; לאחר מכן, aliquot את הליפוזומים בנפחים הרצויים (למשל, 1 מ"ל או 20 מ"ג סה"כ שומנים בצינור פלסטיק 1.5 מ"ל).
        נקודת עצירה: ניתן לעצור את ההליך בשלב זה. יש להקפיא כל אליקוט פעם נוספת (מחזור שלישי) ולאחסן בחנקן נוזלי עד מספר חודשים. דאג לנקב את מכסי הצינור פעמיים עם מחט כדי למנוע פיצוץ של הצינור עם רתיחה מהירה של החנקן הנוזלי.
  2. יום 2
    1. הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה מטוהרים לליפוזומים מוכנים
      1. הפשירו אליקוט אחד של ליפוזומים (סה"כ 20 מ"ג שומנים) באמבט מים בטמפרטורת החדר. בינתיים, הכינו מכבש על ידי מריחת מסנן לפי בחירה (למשל, פוליקרבונט, קוטר נקבוביות של 400 ננומטר); שיווי מראש של המכבש עם Buffer A; ולטעון את הליפוזומים המופשרים ("תמיסת חלב") לתוך המכבש ולהעביר אותם פי 13 דרך המסנן. אספו את הליפוזומים המושחלים (כיום שלפוחיות חד-למלריות גדולות; "תמיסה אטומה") בכלי זכוכית או פלסטיק בגודל מתאים (למשל, 15 מ"ל). לדלל את הליפוזומים ל 4 מ"ג / מ"ל עם Buffer A בתוספת 2 mM DTT.
      2. מעבירים 1 מ"ל של 4 מ"ג/מ"ל ליפוזומים לקובטה שקופה של 1 מ"ל. בספקטרופוטומטר, מדוד את הצפיפות האופטית הראשונית ב- 540 ננומטר. שפכו בחזרה את הדגימה שנמדדה והוסיפו 50 μL של 10% v/v Triton X-100 לליפוזומים.
        הערה: נפח טיטרציה של 50 μL של 10% Triton-X100 מתאים ל-20 מ"ג שומנים בנפח של 5 מ"ל; התוספת של Triton X-100 תדלל את השומנים ב~5%. התאם את עוצמת הטיטרציה בעת עבודה עם כמויות שונות של ליפוזומים. לקבלת אותות צפיפות אופטית יציבה, בצע טיטרציה של הליפוזומים עם Triton X-100 בטמפרטורת החדר.
      3. חזור על שלב 2.2.1.2 ושים לב מתי מגיעים לצפיפות אופטית מרבית (Rsat). המשיכו עם הטיטרציה עד שתגיע לצפיפות אופטית של כ-60% Rsat (איור 4). שפכו את השלפוחיות המעורערות בחומרי ניקוי בחזרה לתוך צינור הזכוכית/פלסטיק (הנפח הסופי הוא כעת כ-5.2 מ"ל), העבירו את הדגימה לקרח ואפשרו לה להתקרר.
      4. הוסיפו את חלבוני הממברנה המטוהרים לליפוזומים המעורערים כדי להגיע ליחס השומנים לחלבון הרצוי (w/w). השתמש ביחס של 400:1 עד 100:1 ואט; מכיוון שגם ל-ArcD וגם ל-GlpT יש משקל מולקולרי של ~55 kDa, יחס ליפידים-לחלבון של 400:1 w/w מתאים ל~30,000 ליפידים לחלבון, ו~ 50 מולקולות של ArcD ו-GlpT כל אחת לכל שלפוחיות בקוטר של 400 ננומטר.
        הערה: כאן אנו משתמשים 400:1 w/w, המקביל ל 50 מיקרוגרם של כל חלבון לכל 20 מ"ג של שומנים.
      5. אגוז את הדגימות ב 4 ° C במשך 15 דקות כדי לאפשר חלבוני הממברנה להחדיר לתוך הממברנה הליפוזומלית מעורערת.
      6. כדי להסיר את חומר הניקוי, להוסיף 200 מ"ג של חרוזי פוליסטירן יבש, מוכן לפי הוראות היצרן. אגוז ב 4 °C למשך 15 דקות נוספות.
        הערה: כמות של 200 מ"ג חרוזים יבשים מתאימה ל-20 מ"ג שומנים, אך יש להתאים אותה כאשר משתמשים בגודל מדגם שונה.
      7. חזור על שלב 2.2.1.6 2x, עבור סך של שלוש תוספות של חרוזי פוליסטירן. לאחר מכן, יש לדגור למשך הלילה ב-4°C עם אגוז עדין.
  3. יום 3
    1. חזור על שלב 2.2.1.6; עם זאת, הפעם, אגוז ב 4 ° C במשך 1 שעות.
    2. אבטח עמוד זרימת כבידה ריק (קיבולת של 10 מ"ל) מעל צינור אולטרה-צנטריפוגה ריק של 6.5 מ"ל על קרח. יוצקים את הדגימה לעמודה ואוספים את הפרוטאוליפוזומים בצינור האולטרה-צנטריפוגה (החרוזים נשמרים בטור).
    3. לשטוף את החרוזים עם 0.5 מ"ל של חיץ A בתוספת 2 mM DTT ולאסוף את המסנן בצינור ultracentrifugation.
    4. רכז את הפרוטאוליפוזומים על ידי אולטרה-צנטריפוגה (337,000 × גרם, 30 דקות, 4 oC). להשהות מחדש את הפרוטאוליפוזומים בנפח כולל של 200 μL (100 מ"ג של שומנים/מ"ל) במאגר A בתוספת 2 mM DTT; הנפח היבש של השלפוחיות לאחר הצנטריפוגה הוא ~ 40 עד 120 μL27. מחולק aliquots בגודל הרצוי (למשל, שלושה aliquots של 6.66 מ"ג של שומנים סה"כ).
      הערה: גודל aliquot הוא שרירותי אך ישפיע על גודל הגלולה בשלבים מאוחרים יותר (ראה שלב 3.2.3.1). נקודת עצירה: ניתן לעצור את ההליך כאן. יש להקפיא במהירות הבזק כל aliquot ולאחסן בחנקן נוזלי עד מספר שבועות. יש להקפיד לנקב את מכסי הצינור פעמיים באמצעות מחט כדי למנוע פיצוץ של הצינור בעת רתיחה מהירה של החנקן הנוזלי.

Figure 4
איור 4: טיטרציה של ליפוזומים מוכנים עם Triton X-100. ליפוזומים במינון 5 מ"ג ליפידים/מ"ל מושחלים דרך מסנן פוליקרבונט (400 ננומטר) ב-50 mM KPi (pH 7.0) ולאחר מכן מתוארים עם Triton X-100 (שלב פרוטוקול 2.2.1.2). עכירות השלפוחיות נמדדת ב-A540. החץ מציין את ריכוז טריטון X-100 שבו השלפוחיות מעורערות מספיק לצורך החדרה ספונטנית של חלבוני ממברנה כמתוארב-19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. אנקפסולציה של רשת מטבולית למחזור ATP וסינתזה של גליצרול 3-P בשלפוחיות בגודל תת-מיקרוני

  1. יום 1
    1. ערבוב רכיבים
      1. עבור אנקפסולציה סטנדרטית, השתמש 66.6 μL של proteoliposomes בנפח סופי של 200 μL (33.33 מ"ג / מ"ל של שומנים בסך הכל). חשב את הנפח של כל רכיב (אנזים, קו-פקטור) הדרוש כדי להגיע לריכוז הרצוי, הוסף רכיבים אלה לפרוטאוליפוזומים וכוונן את הנפח ל-200 מיקרוליטר עם חיץ A (טבלה 2).
        הערה: ניתן להתאים את ריכוז החלבון בהתבסס על מערך הניסוי. עם זאת, יש להקפיד כי מספר עותקים (>10) של כל אנזים נמצאים בממוצע לכל שלפוחית, כדי למנוע השפעות סטוכסטיות בלתי רצויות. ריכוזים > 1 מיקרומטר הם בדרך כלל בטוחים; 1 מיקרומטר בשלפוחית בקוטר של 400 ננומטר מתאים לכ-20 עותקים (איור 3).
      2. חיץ פיפטה A לתוך צינור ריק של 1.5 מ"ל והוסף את DTT, Na-ADP, MgCl2, L-ornithine (ופירנין, במידת הצורך למדידות pH פנימיות). לאחר מכן, מוסיפים את האנזימים ומערבבים בעדינות. מוסיפים את התמיסה על גבי הפרוטאוליפוזומים המוכנים, ומערבלים לזמן קצר במהירות נמוכה.
        הערה: חשוב להוסיף Na-ADP לפני MgCl2 כדי למנוע היווצרות בלתי רצויה של משקעים של מגנזיום פוספט. מערבולת נדרשת לערבוב נכון של התמיסה הצמיגית; עם זאת, מזערו את משך הזמן והמהירות כדי למנוע נזק מכני לחלבונים. PercevalHR ופירנין אינם ניתנים למעטפת משותפת מכיוון שהספקטרום שלהם חופף.
    2. קביעת אוסמולליות פנימית
      1. הכינו תמיסה של 50 μL כמתואר בשלב 3.1.1.1 אך ללא פרוטאוליפוזומים, ומדדו את האוסמוליות באמצעות אוסמומטר של נקודת הקפאה.
      2. הכינו עקומת כיול באמצעות חיץ (50 mM KPi pH 7.0) וריכוזים משתנים של מלח (למשל, NaCl או NaCl) או סוכר. לקבוע את ריכוז האוסמוליטים התואם את האוסמוליות הפנימית (Buffer N).
        הערה: לא ניתן להשתמש ברכיבים חדירים של הממברנה (למשל, גליצרול) כדי להתאים לאוסמוליות הפנימית. עבור חלבונים המסיסים במאגר המכיל גליצרול (למשל, Buffer E), יש להשתמש באותו חיץ ללא גליצרול. האוסמוליט שנבחר להכנת חיץ חיצוני איזו-אוסמוטי צריך להיות אטום לקרום ולא להפריע לרשת המטבולית.
    3. הפשרה בהקפאה
      1. להקפיא במהירות הבזק (בחנקן נוזלי) את הפרוטאוליפוזומים יחד עם הרכיבים המסיסים, ולהפשיר באמבט מים-קרח בטמפרטורה של כ-10°C.
      2. חזור על שלב 3.1.3.1 עבור סך של 5x.
        נקודת עצירה: ניתן לעצור את ההליך כאן. דלג על שלב ההפשרה האחרון, ואחסן את הדגימה הקפואה בחנקן נוזלי למשך 1-3 ימים. יש להקפיד לנקב את מכסי הצינור 2x עם מחט כדי למנוע פיצוץ של הצינור בעת רתיחה מהירה של החנקן הנוזלי. אחסון בחנקן נוזלי עדיף על פני -80°C כדי למזער חמצון שומנים.
  2. יום 2
    1. שחול
      הערה: כל שלבי האקסטרוזיה מבוצעים בטמפרטורת החדר, מכיוון שהמזרקים האטומים לגז ידלפו אחרת.
      1. הכינו מכבש על ידי מריחת מסנן לפי בחירה (למשל, פוליקרבונט, קוטר נקבוביות של 400 ננומטר). שטפו את המכבש בתמיסה המכילה את אותו חיץ ומטבוליטים המשמשים לאנקפסולציה של השלפוחיות (למשל, Buffer O בתוספת 0.1 mM pyranine).
        הערה: השתמש במכבש ייעודי להעמסת פרוטאוליפוזומים עם פירנין מכיוון שהצבע נדבק למשטח המכבש ועלול לגרום לזיהום בדגימות מאוחרות יותר.
      2. טען את תערובת האנקפסולציה במכבש, והעבר אותה דרך המסנן 13x. לאסוף את הפתרון extruded בצינור 1.5 מ"ל.
    2. כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (אופציונלי)
      הערה: שלב זה מבוצע כדי להסיר מולקולות חיצוניות כגון צבעים כמו פירנין על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. אם צבעים אינם קיימים במערכת, ורכיבים אחרים אינם מפריעים בריכוזים נמוכים (שימו לב כי השלפוחיות נשטפות לאחר מכן גם על ידי אולטרה-צנטריפוגה), שלב 3.2.2. ניתן לדלג.
      1. התייבשו את שרף Sephadex G-75 ומזגו אותו לעמוד זכוכית (22 ס"מ אורך, 1.5 ס"מ רוחב). אזנו את השרף עם עודף של חיץ חיצוני (למשל, חיץ N).
      2. טען את הפרוטאוליפוזומים המושחלים משלב 3.2.1.2 על עמודת הכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל משוונת מראש והחל זרימת כבידה של חיץ חיצוני. השלכת נפח הריק (כ -7 מ"ל); לאחר מכן, לאסוף עשרה 1 מ"ל aliquots. דמיינו את האליציטוטים המכילים פרוטאוליפוזומים על ידי חשיפה קצרה למנורת UV. אגרו את השברים המכילים את רוב הפרוטאוליפוזומים (2-4 מ"ל).
    3. כביסה ומתלים
      1. לשטוף את proteoliposomes extruded על ידי ultracentrifugation. מלא צינור אולטרה-צנטריפוגה של 6.5 מ"ל עם 5.8 מ"ל של Buffer N, והחל את הדגימה המורחבת על גבי. אם בוצעה כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, מלא את הצינור בדגימות האלוציה המאוגמות (2-4 מ"ל) והוסף את Buffer N לנפח סופי של 6 מ"ל.
      2. צנטריפוגה ב 337,000 × גרם, 30 דקות, 4 ° C. יש להשליך את הסופרנטנט, ולייבש היטב את צינור האולטרה-צנטריפוגה עם רקמה נטולת אבק תוך שימת לב לא לגעת בכדור. השהה מחדש את הגלולה בנפח קטן של Buffer N (200 μL). כאשר הגלולה תלויה במלואה, מלא את הצינור עד 6 מ"ל עם חיץ N.
        הערה: השעיה מחדש של הגלולה תיקח זמן ויש לעשות זאת בזהירות.
      3. חזור על שלבים 3.2.3.1-3.2.3.2 2x, עבור שלוש כביסות בסך הכל, אלא אם כן בוצעה כרומטוגרפיה של חריגת גודל (ובמקרה זה שלב צנטריפוגה אחד מספיק). בסופו של דבר, יש להשהות מחדש את הגלולה לריכוז הרצוי (למשל, 5.55 מ"ג/מ"ל סה"כ שומנים) על ידי הוספת נפח מתאים של Buffer N.
        נקודת עצירה: ניתן להשתמש בפרוטאוליפוזומים באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלותצלזיוס למשך 48 שעות לפחות. יש לבחור את גודל צינורות האולטרה-צנטריפוגה בהתבסס על גודל המדגם. עבור גלולה של 6.66 מ"ג של שומנים סה"כ, צינור 6.5 מ"ל מתאים. שטיפה של 200 μL של פרוטאוליפוזומים (33.33 מ"ג שומנים / מ"ל בסך הכל; נפח גלולה יבשה ~ 40 μL)28 עבור 3 x 6 מ"ל של חיץ מדלל את הרכיבים החיצוניים פי 100 עבור כל שלב כביסה. אם משתמשים בצינורות בגדלים שונים, רצוי להתאים את מספר השטיפות בהתאם.
  3. יום 3
    1. זיהוי סינתזת ATP על ידי פלואורסצנטיות
      1. ערבבו את רכיבי התגובה לנפח סופי של 120 μL (טבלה 3) בקובט קוורץ שחור עם חלון של 3 x 5 מ"מ ונפח פנימי מינימלי של 100 μL.
        הערה: ניתן להוסיף יונופורים כדי לפזר שיפועי יונים אלקטרוכימיים. תערובת של ולינומיצין וניגריצין (1 מיקרומטר כל אחד) מפזרת ביעילות את כל שיפועי הפרוטון והאשלגן.
      2. מחממים מראש את הדגימה בפלואורומטר המוגדר ל-30°C ומקבלים ספקטרום עירור של PercevalHR (עירור 400-520 ננומטר, רוחב פס 5 ננומטר; פליטה 550 ננומטר, רוחב פס 5 ננומטר). ברגע שאות הגשושית קבוע, התחל את הרשת המטבולית על ידי תוספת של עודף של L-ארגינין (5-10 מילימטר), וגליצרול (400 מיקרומטר) כאשר מחזור ATP מוצמד לסינתזה של גליצרול 3-פוספט. עקוב אחר התגובה לאורך זמן.
    2. ניתוח נתונים
      1. התווה את היחס F500/F430 כפונקציה של זמן, המהווה אינדיקטור איכותי ליחס ATP/ADP. להערכה כמותית יותר של היווצרות ATP, בנו עקומת כיול בפרוטאוליפוזומים או השתמשו בגישה משלימה (למשל, כימות ATP על ידי כימילומינסנציה28).
רכיב ריכוז סופי
חיץ א' 50 mM KPi pH 7.0
DTT 2 מ"מ
נא-ADP 10 מ"מ
MgCl2 10 מ"מ
ל-אורניתין 0.5 מ"מ
בדיקה פלואורסצנטית (PercevalHR או pyranine) 5.8 מיקרומטר או 0.1 מילימול, בהתאמה
ארקה (Arginine deiminase) 1 מיקרומטר
ArcB (אורניתין carbamoyltransferase) 2 מיקרומטר
ArcC1 (קרבמט קינאז) 5 מיקרומטר
GlpK (גליצרול קינאז) 1.6 מיקרומטר
פרוטאוליפוזומים 33.33 מ"ג/מ"ל סה"כ שומנים

טבלה 2: רכיבי אנקפסולציה. הרכיבים מפורטים לפי סדר התוספת. חלבונים מסיסים נמצאים בחיץ E; כל שאר הרכיבים (למעט MgCl2, במים נטולי יונים) נמצאים במאגר A.

רכיב ריכוז סופי
חיץ K 50 mM KPi pH 7.0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7.0
פרוטאוליפוזומים (5.55 מ"ג/מ"ל שומנים) 2.7 מ"ג / מ"ל של שומנים
יונופורים (valinomycin, nigericin) 1 מיקרומטר כל אחד

טבלה 3: תנאי ניסוי. הרכיבים מפורטים לפי סדר התוספת. פרוטאוליפוזומים נמצאים בחיץ N, יונופורים ב-DMSO או EtOH.

4. שדרוג רשת מטבולית לשלפוחיות בגודל מיקרומטר

  1. יום 1
    1. הכנת שבב מיקרופלואידי
      הערה: ניסוי זה משתמש במכשיר מיקרופלואידי שפותח על ידי Robinson et al.34. עיצובים אחרים של שבבים microfluidic זמינים 35,36,37 וניתן ליישם בקלות בפרוטוקול זה.
      1. חותכים קצה צינור של 200 μL שליש מלמטה ומכניסים את החלק התחתון של הקצה למכשיר לכידה מיקרופלואידית מוכן מראש.
      2. למאגר הכניסה של השבב, הוסף 400 μL של תמיסת β-קזאין (2 מ"ג / מ"ל; ראה שלב 1.5), תוך הקפדה על מניעת הכנסת אוויר בשלב זה. מניחים דלי צלחת 96 בארות ומוסיפים רקמת מעבדה בצנטריפוגת צינור חרוטי שולחנית. מניחים את השבב על גבי הרקמה והצנטריפוגה למשך 6 דקות ב 900 × גרם כדי לאפשר פסיבציה של השבב microfluidic. לאחר שלב הצנטריפוגה, רמת הנוזל צריכה להיות שווה על מאגר הכניסה וקצה היציאה של השבב המיקרופלואידי; בדוק אם יש דליפה של השבב. לדגור על תמיסת β-קזאין בשבב המיקרופלואידי למשך 30 דקות לפחות.
      3. הסר את רוב תמיסת הפסיבציה מבלי להכניס אוויר והוסף 400 μl של חיץ כביסה (חיץ P). מניחים את השבב על דלי צלחת 96 בארות וצנטריפוגה ב 900 × גרם במשך 6 דקות. השאירו את השבב בתמיסת הכביסה עד לשימוש (למשך 4 שעות לכל היותר).
  2. הכנת ג'ל לייצור proteo-GUV
    הערה: התיאור הבא נלקח והותאם מ-25,38.
    1. להמיס 0.5% (w/w) של אגרוז בטמפרטורה נמוכה (LGT) במים נטולי יונים, על ידי חימום התמיסה במיקרוגל; יש לוודא שהאגרוז התמוסס לחלוטין ולהימנע מהרתחת התמיסה. שמור את agarose ב 50 ° C עד לשימוש חדש.
      הערה: אגרוז מומס ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר שבועות. כדי להשתמש מחדש באגרוז, פשוט המיסו את הג'ל באמצעות מיקרוגל.
    2. קח שתי שקופיות אובייקטיביות וצייר את קווי המתאר של המרווח על השקפים. הפוך את המגלשות הידרופיליות על ידי ניקוי פלזמה, באמצעות פלזמה חמצן גבוהה במשך 1 דקה.
    3. הוסף אגרוז LGT על גבי המגלשה עד שהוא מכוסה במלואו באגרוז (~ 500 μL); לאחר מכן, הטה את המגלשה בזווית של 90 ° ונקז עודפי אגרוז על רקמה. השאירו את המגלשות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 50°C.
    4. קח פרוטאוליפוזומים המאוחסנים בחנקן נוזלי (סעיף 3) והפשיר על קרח. לדלל את השלפוחיות ל 5 מ"ג / מ"ל של שומנים באמצעות חיץ Q.
      הערה: פרוטאוליפוזומים שהוכנו בסעיף 3 אינם מכילים חלבונים מסיסים וניתן להכין אותם זמן רב מראש אם הם מאוחסנים בחנקן נוזלי. כאשר עובדים עם proteoGUVs, הקפד תמיד לסנן את פתרונות העבודה כדי למנוע סתימה של המכשיר microfluidic.
    5. סוניק את הפרוטאו-ליפוזומים באמצעות סוניק בדיקה ידני עם בדיקה 1 מ"מ. סוניק במשך 10 מחזורים של 0.5 שניות הפעלה ו-0.5 שניות כבויות באמפליטודה של 70%. שמור את השלפוחיות, המכונות להלן proteoSUVs, על קרח במשך 30 שניות, וחזור על תהליך הסוניקציה 5x.
    6. מלא מזרק 100 μL (במתקן LCP ידני) במתלי proteo-SUV. הפקדה 0.5 μL טיפות של proteo-SUV על ג'ל agarose שהוכן בעבר; יש להיזהר שלא להפריע לשכבת האגרוז ולשמור על מרחק מספיק כדי למנוע מהטיפות להתמזג.
      הערה שימוש במתקן LCP ידני מאפשר שיקוע טיפות באופן הניתן לשחזור, אך ניתן להשתמש גם במערכות צנרת חלופיות. איתור עם נימי זכוכית פחות מתאים מכיוון שהוא מפריע לג'ל האגרוז המיובש.
    7. יבש את טיפות SUV ב~ 10 דקות באמצעות זרימת חנקן במקום אוויר דחוס כדי להפחית את האפשרות של חמצון השומנים.
    8. הכינו 1 מ"ל של חיץ מרוכז פי 1.25 O (טבלה 4) בחיץ A ועברו דרך מסנן תאית אצטט בגודל 0.2 מיקרומטר. קח 800 μL של תמיסה מרוכזת 1.25x והוסף את האנזימים והבדיקות המסיסים לריכוז כפי שמצוין בטבלה 4. השתמש במים מסוננים deionized כדי להפוך את נפח הסופי 1 מ"ל.
    9. הכינו 100 מיקרוליטר של תמיסת נפיחות המכילה את כל מרכיבי טבלה 4, למעט חלבונים וגליצרול. מדוד את האוסמוליות של תמיסת הנפיחות באמצעות אוסמומטר נקודת הקפאה מכויל בן 3 נקודות.
      הערה: הכינו 100 מיקרוליטר של תמיסת נפיחות ללא חלבון וגליצרול כדי לקבוע במדויק את האוסמוליות של תמיסה זו. גליצרול, הנמצא בתמיסת החלבון, משפיע על האוסמוליות, אך ב- GUVs, גליצרול מתפזר במהירות על פני הממברנה ורק מוביל להבדלים אוסמוטיים חולפים.
    10. הרכיבו את תא הנפיחות של GUV על ידי הכנת סנדוויץ' של שתי כוסות אובייקטיביות המכילות את הג'ל ורכבי שטח מיובשים עם ספייסר טפלון בעובי 1.5 או 3.0 מ"מ ביניהם. לאחר מכן, להוסיף את פתרון נפיחות בחדר דרך החור הקטן בצד באמצעות מזרק ומחט.
      הערה: ניתן לכוונן את נפח תמיסת הנפיחות על ידי שינוי הספייסרים מ-1.5 ל-3.0 מ"מ.
  3. נפיחות של שלפוחיות וקציר של GUVs
    1. אפשר נפיחות של שלפוחיות על ידי הצבת החדר ב 22 °C למשך 30 דקות לפחות.
      הערה: הנפיחות של השלפוחיות יכולה להיות מלווה במיקרוסקופ אור, (למשל, מיקרוסקופ ניגוד פאזה שולחנית או מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב-שדה) אם החלבונים או השומנים מסומנים באופן פלואורסצנטי.
    2. קצרו את הגובים מהג'ל על ידי מריחת תסיסה פיזית עדינה על ידי הקשה על התא על משטח מוצק (למשל, ספסל מעבדה); הוציאו שליש מהנפח והשתמשו בבועת האוויר שנוצרה כדי לגרום בעדינות לתנועה לנוזל שנותר ובכך לנתק את ה-GUV מהג'ל.
    3. בזמן שה-GUV מתנפחים, הכינו את חיץ P והתאימו את האוסמוליות לתמיסת הנפיחות על ידי התאמת ריכוז הגלוקוז. סנן את המאגר דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר.
      הערה: באופן כללי, יש לשמור את תמיסת הכביסה והמצע בטווח של ± 5 מוסמול/ק"ג. כל תמיסה שעוברת דרך השבב צריכה להיות נקייה מאוד מכיוון שמזהמים עלולים לסתום את התעלות. הכינו מאגרים טריים בכל פעם או אחסנו מאגרים מוכנים בטמפרטורה של -20°C וסננו לפני השימוש.
  4. לכידת ה- GUV לניסויים במיקרוסקופ
    1. הר את שבב microfluidic פסיבי על שלב הדגימה של המיקרוסקופ. בדוק פגמים אפשריים (למשל, דליפות, אוויר לכוד, ערוצים סתומים).
      הערה: בדיקת השבב יכולה להיעשות היטב לפני השימוש כך שניתן יהיה להכין שבב חדש במידת הצורך.
    2. חבר את הצינור באמצעות מחט כפופה למוצא המאגר וחבר את הקצה השני למזרק 1 מ"ל. הרכיבו את המזרק על משאבה וכוונו את קצב הזרימה למקסימום של 10 מיקרוליטר/דקה.
    3. הסר את חיץ הכביסה מהמכל (שלב 4.1.1.3) והחלף במדיום טרי (חיץ P). התחל את זרימת החיץ דרך השבב על ידי עירוי דרך המזרק ב 1-10 μL / min. יש לכבס עם לפחות 80 μL של חיץ כביסה מאוזן אוסמוטית (Buffer P).
    4. הסר את חיץ השטיפה העודף מהמאגר והוסף את ה- GUV (proteo) למאגר. כוונן את קצב הזרימה ל- 0.1- 1 מיקרוליטר לדקה כדי לאפשר ל- GUV לזרום דרך השבב. נטר את השבב לאורך זמן עד שמספיק GUV נלכדו בשבב.
      הערה: שלפוחיות עם כמויות גדולות יחסית (>20 מול%) של שומנים טעונים כגון פוספטידילגליצרול (PG), פוספטידיל סרין (PS) או חומצה פוספטידית (PA) או ליפידים שאינם יוצרים דו-שכבתיים כמו פוספטידיל-אתנולאמין (PE) מוחדרים בקצב זרימה נמוך יותר דרך השבב כדי למנוע התפוצצות. שלפוחיות המורכבות מפוספטידילכולין טהור (PC) נוטות להיות יציבות יותר.
    5. הסר תמיסת GUV עודפת והוסף חיץ כביסה P, באמצעות זרימה קבועה של 0.1-1 מיקרוליטר לדקה, כדי להחליף את התווך החיצוני ולשטוף את ה- GUV הלכודים למשך שעה אחת לפחות כדי להסיר תרכובות שאינן עטופות ולהוריד את פלואורסצנטיות הרקע כאשר פלואורופור עטוף. לפקח על פלואורסצנטיות הרקע לאורך זמן; אם פלואורסצנטיות הרקע אינה יורדת, השבב עלול להיחסם.
    6. למקם מלכודות עם כמויות מספיקות של שלפוחיות ולשמור את מיקומן. החל את ההגדרות על המיקרוסקופ (למשל, עוצמת לייזר, רווח, אורך גל) והתחל ניסוי סדרת זמן.
    7. הוסף תמיסת מצע מאוזנת אוסמוטית (חיץ R) למאגר והתחל קצב זרימה של 0.5 מיקרוליטר לדקה.

רכיבי Buffer L
רכיב ריכוז פי 1.25 ריכוז עבודה
חיץ א' 62.5 mM KPi pH 7.0 50 mM KPi pH 7.0
סוכרוז 125 מ"מ 100 מ"מ
DTT 2.5 מ"מ 2 מ"מ
נא-ADP 12.5 מ"מ 10 מ"מ
MgCl2 12.5 מ"מ 10 מ"מ
ל-אורניתין 0.625 מ"מ 0.5 מ"מ
רכיבי אנקפסולציה
Pyranine או PercevalHR 1 מ"מ או 20 מיקרומטר
ארקה (Arginine deiminase) 1 מיקרומטר
ArcB (אורניתין carbamoyltransferase) 2 מיקרומטר
ArcC1 (קרבמט קינאז) 5 מיקרומטר

טבלה 4: רכיבי חיץ O ואנקפסולציה. הרכיבים מפורטים לפי סדר התוספת. כל הרכיבים (למעט MgCl2, במים נטולי יונים) נמצאים במאגר A. רכיבי אנקפסולציה מפורטים לפי סדר החיבור. כל החלבונים המסיסים במים נמצאים במאגר E.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה מסיסים בליפוזומים דורשת ערעור היציבות של שלפוחיות מוכנות. תוספת של כמויות נמוכות של Triton X-100 גורמת בתחילה לעלייה בספיגה של 540 ננומטר (A540) עקב עלייה בפיזור האור על-ידי נפיחות השלפוחיות (איור 4). הערך המרבי A540 הוא הנקודה שבה הליפוזומים רוויים בחומר ניקוי (Rsat), ולאחר מכן כל תוספת נוספת של טריטון X-100 תגרום למסיסות חלקית של השלפוחיות. ב-Rsol, הליפוזומים מסיסים לחלוטין (איור 4). לצורך הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה, אנו משתמשים בדרך כלל בשלפוחיות שהתערערו ל-60% מעבר ל-Rsat (מסומן בחץ).

חלבון הממברנה המשוחזר ArcD משמש להובלת L-ארגינין לתוך ו-L-אורניתין אל מחוץ לשלפוחיות ומשמש יחד עם האנזימים הכמוסים ArcA, ArcB ו-ArcC כדי למחזר ATP מ-ADP ופוספט אנאורגני. GlpT הוא אנטיפורטר גליצרול 3-פוספט/פוספט שיחד עם GlpK נחוץ לסינתזה (והפרשה) של גליצרול 3-פוספט מגליצרול בתוספת ATP המיוצר על ידי פירוק L-ארגינין. התוספת של 5 mM L-arginine ב-t = 0 לפרוטאוליפוזומים גורמת לעלייה תלולה ביחס של פלואורסצנטיות PercevalHR ב-500 ו-430 ננומטר עירור39, אשר משקף את יחס ATP/ADP בתוך השלפוחיות (איור 5). עם הוספת גליצרול, ה-ATP משמש לסינתזה של גליצרול 3-פוספט, מה שמביא להורדת יחס ATP/ADP28. פירוק L-ארגינין מוביל גם לשינויים ב-pH, אותם ניתן לכמת באמצעות פירנין או pHluorin27.

Figure 5
איור 5: מיחזור ATP על-ידי מסלול פירוק L-ארגינין. LUVs ב 2.7 מ"ג של שומנים / מ"ל ממוקמים בקובט ואת היחס של פלואורסצנטיות ב 500 ננומטר ו 430 ננומטר נרשם. 5 mM של L-arginine מתווסף ב t = 0. יחס F500/F430 הוא מדד ליחס ATP/ADP בתוך השלפוחיות. קיצור: LUVs = שלפוחיות חד-לאומיות גדולות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתן להשתמש ב-LUV המייצרים ATP גם ליצירת GUVs. התייבשות של פרוטאו-LUV מיובשים על ג'ל אגרוז LGT גורמת להיווצרות שלפוחיות בגודל מיקרומטר (איור 6). היווצרות פרוטאו-GUV בתוך כתמי LUV מיובשים תלויה במידה רבה בריכוז המקומי של שומנים ובמידת ההתייבשות. באזורים מסוימים יש טלאים גדולים של GUVs, בעוד שבמקומות אחרים באותה טיפה, לא ניתן ליצור GUV או מעטים. היווצרות GUV באמצעות נפיחות בסיוע LGT גורמת למגוון גדלים של GUV, בדרך כלל ממיקרומטרים בודדים ועד יותר מ-50 מיקרומטר.

Figure 6
איור 6: תמונות DIC של proteoGUV שנוצרו על-ידי נפיחות בעזרת ג'ל. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצורים: DIC = ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית; GUVs = שלפוחיות ענק-unilammellar. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ה-GUV נקצרים ונלכדים במכשיר מיקרופלואיד פסיבי מבוסס PDMS מבוסס β-קזאין (איור 7). המכשיר מתוכנן כך שניתן ללכוד ולנתח שלפוחיות רבות בניסוי אחד, והמכשיר משמש לשליטה בסביבה החיצונית (קצב זרימה, הרכב חיץ וכו ') 34. גם כאשר התפוקה של פרוטאו-GUV נמוכה, הזרימה המתמדת של GUV דרך השבב המיקרופלואידי מאפשרת איסוף שלפוחיות רבות. ברגע שנלכדים מספיק GUV, המערכת נשטפת במאגר מאוזן אוסמוטית כדי להסיר רכיבים חיצוניים כגון חלבונים מסיסים, מולקולות קטנות וגשושיות פלואורסצנטיות. לאחר מכן מוחלף מאגר הכביסה בתמיסת מצע בעלת אוסמולליות שווה המכילה 50 mM KPi (pH 7.0), כמויות משתנות של גלוקוז (כדי להתאים את האוסמוליות), ומצעים כגון 10 mM L-arginine. ניסוי בסדרת זמן נעשה על מספר מלכודות של השבב המיקרופלואידי ותמונות נלקחות כל 90 שניות (עירור של 405 ננומטר ו- 488 ננומטר כאשר משתמשים ב- PercevalHR). יתר על כן, תמונת שדה בהיר נלקחת בכל נקודת זמן. היחס בין עוצמות הפליטה לאחר עירור ב-488 ו-405 ננומטר הוא מדד ליחס ADP/ATP בשלפוחיות.

Figure 7
איור 7: לכידת שלפוחיות באמצעות השבב המיקרופלואידי. (A) לכידה של השלפוחיות, המלווה ביכולת לשלוט בסביבה החיצונית ובקצב הזרימה. (B) ProteoGUV לכודים במכשיר מיקרופלואידי ומעוררים באמצעות לייזר 405 ננומטר (ירוק) ולייזר 488 (אדום). הפליטה לשני הערוצים נמדדת ב->500 ננומטר. תמונת השדה הבהיר מאפשרת הדמיה של השלפוחיות ללא פלואורסצנטיות. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצור: GUVs = שלפוחיות ענקיות-חד-לאומיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של חלבון (ממברנה) המכיל שלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטרי (proteoLUVs), והמרה של proteoLUVs לשלפוחיות ענקיות-חד-לאומיות (proteoGUVs). הפרוטוקול צריך להיות ישים להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה אחרים 13,19,30,40 ולאנקפסולציה של רשתות מטבוליות אחרות מלבד מסלולי פירוק L-ארגינין וסינתזה של גליצרול 3-פוספט המוצגים כאן.

ההרכבה מחדש של חלבוני הממברנה בליפוזומים מניבה בדרך כלל כיוון אקראי של החלבונים בתוך קרום השומנים. עבור ArcD ו- Glpt, הכיוון אינו משנה, מכיוון שהחלבונים פועלים באופן דו-כיווני והמומסים נעים בהתאם לסימן הפוטנציאל האלקטרוכימי הכולל. עבור חלבונים הפועלים בכיוון אחד, מחצית מהמולקולות לא יהיו זמינות לפעילות כאשר הכיוון שלהן הוא 50/50.

האקסטרוזיה של שלפוחיות דרך מסנן פוליקרבונט מצמצמת את התפלגות הגודל, והשלפוחיות הופכות הומוגניות יותר ככל שגודל הנקבוביות של המסננים קטן יותר. עם זאת, שלפוחיות קטנות יותר מגיעות במחיר של נפח קטן יותר ולכן, מספר קטן מאוד של חלבונים (אנזימים, חלבוני ממברנה) לכל שלפוחית. כדי למזער את החלק של LUVs שיש להם רכיב אחד או יותר חסר, ניתן להתאים את ריכוז החלבונים כפי שמוצג באיור 3A,B, אבל עם שלפוחיות קטנות מאוד השפעות סטוכסטיות הן בלתי נמנעות.

שיטת הנפיחות בעזרת ג'ל מסתמכת על שקיעת שלפוחיות סוניות (SUV) על משטח אגרוז מיובש. במהלך תהליך הייבוש נוצר שיפוע ריכוז של שלפוחיות וריכוז השומנים הוא הגבוה ביותר בשולי המקום. זאת בשל תופעה המכונה אפקט כתם הקפה41,42. כתוצאה מכך, רק אזור קטן בתוך המקום מכיל ריכוז של שומנים המתאימים להיווצרות GUV. כתמי שומנים עגולים לא אחידים גורמים לאזורים גדולים שאינם בשימוש שאינם זמינים לאיחוי שלפוחית; לפיכך, היעילות של היווצרות GUV הופכת נמוכה בגישה זו. כדי להגדיל את התפוקה של GUVs, יש לשאוף לשיקוע שומנים אחיד, אשר יכול להתבצע על ידי ציפוי סחרור42 או מינוף אפקט כתם הקפה41.

הערות נוספות על הפרוטוקול:

יש להקפיד על כך שמספר חלבוני ממברנה (>10) ישוחזרו בממוצע לכל שלפוחית כדי למנוע השפעות סטוכסטיות. לכן, הימנעו מיחס שומנים לחלבון גבוה מ-400:1 w/w. מניחים כיוון אקראי עבור רוב החלבונים.

באופן אידיאלי, נפח חלבוני הממברנה הכולל הוא קטן ככל האפשר ובכל מקרה אינו עולה על 10-20% מנפח הליפוזום. הוספת נפחים גדולים יותר תכניס יותר חומרי ניקוי ורוב הליפוזומים המוכנים עשויים ליזה, מה שיכול להשפיע לרעה על יעילות הבנייה מחדש.

שיווי משקל מראש של המכבש עם הפתרון המתאים חשוב כדי למנוע דילול של הרכיבים במהלך האנקפסולציה. באופן אידיאלי, תמיסת קדם-שיווי משקל צריכה להכיל גם את האנזימים המסיסים, אך הכללת אנזימים עלולה להיות יקרה מדי בשל הנפח הגדול יחסית הדרוש לשיווי משקל מראש של המכבש. לכן, אנו בדרך כלל משמיטים רכיבים אלה ומקבלים דילול של 5% של האנזימים.

יש להוסיף יונופורים לתערובות המכילות פרוטאוליפוזומים מכיוון שהמולקולות הידרופוביות מאוד ועלולות להיספג למשטחים אם אין שלפוחיות. יש להקפיד שנפח הממס שנוסף יהיה נמוך (<1% מנפח התגובה הכולל). הבקרות נעשות כדי לוודא שהממסים אינם משפיעים על הרשתות המטבוליות בשלפוחיות. ריכוזי יונופור של כ -1 מיקרומטר בטוחים בדרך כלל לריכוז שומנים כולל של ~ 3 מ"ג / מ"ל.

יש להקפיד לייבש את הטיפות ביסודיות. אם הטיפות אינן יבשות מספיק, היווצרות GUV פחות יעילה מכיוון ששומנים ייצרו אגרגטים של שומנים ו- MLV עשויים להיווצר כאשר מוסיפים את תמיסת הנפיחות.

גלוקוז משמש כדי להתאים את האוסמולריות של המדיום החיצוני למדיום הפנימי; האחרון מכיל סוכרוז במקום גלוקוז כדי להגדיל את צפיפות השלפוחיות ובכך להקל על שיקוע של GUVs. יתר על כן, גלוקוז בסביבה החיצונית משפר את ניגודיות הפאזה, מה שהופך את השלפוחית גלויה יותר.

אפקטים סטוכסטיים הם הרבה פחות בעיה עם GUVs; אבל כאן, יחס פני השטח לנפח יכול להיות נמוך באופן בלתי מתקבל על הדעת כך שמספר חלבוני הממברנה (למשל, טרנספורטרים) הופך למגביל עבור הרשת המטבולית הפנימית. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה אינה מאפשרת שליטה מדויקת על גודל הפרוטאו-GUVs אך רובם נופלים בטווח הגדלים של 5-50 מיקרומטר.

לסיכום, העבודה המוצגת כאן מספקת סקירה מקיפה של בנייה מחדש של חלבון ממברנה ואנקפסולציה של אנזימים בשלפוחיות שומנים בגדלים שונים. אנו מדגימים בניית שלפוחיות פונקציונליות לסינתזה של ATP ואבני בניין מקודמנים פשוטים כגון חומצות אמינו וגליצרול. בנייה מחדש של חלבוני ממברנה ב-GUV נותרה מאתגרת, אך הפרוטוקולים המוצגים כאן סוללים את הדרך להתפתחויות נוספות במחקר הביולוגיה הסינתטית מלמטה למעלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרס כלכלי מתחרה.

Acknowledgments

המחברים מודים לאדיטיה אייר על שיבוט הגן pBAD-PercevalHR ולגיאה שורמן-וולטרס על הסיוע בייצור וטיהור חלבונים. המחקר מומן על ידי תוכנית הכבידה של NWO "בניית תא סינתטי" (BaSyC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Aldrich A9414-25g
Amicon cut-off filter Sigma Aldrich Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeads BioRad 152-3920
CHCl3 Macron Fine Chemicals MFCD00000826
D(+)-Glucose Formedium -
D(+)-Sucrose Formedium -
DDM Glycon D97002 -C
Diethyl Ether Biosolve 52805
DMSO Sigma-Aldrich 276855-100ml
DOPC Avanti 850375P-1g
DOPE Avanti 850725P-1g
DOPG Avanti 840475P-1g
DTT Formedium  DTT005
EtOH J.T.Baker Avantor MFCD00003568
Extruder Avestin Inc LF-1
Fluorimeter Jasco Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol BOOM 51171608
Gravity flow column Bio-Rad 732-1010
Hamilton syringe 100 µL Hamilton 7656-01
Hamilton syringe 1000 µL Hamilton 81320
Handheld LCP dispenser Art Robbins Instruments 620-411-00
Handheld Sonicator Hielscher Ultrasound Technology UP50H
HCl BOOM x76021889.1000
Imidazole Roth X998.4-250g
K2HPO4 Supelco 1.05099.1000
KCl BOOM 76028270.1
KH2PO4 Supelco 1.04873.1000
Kimwipe Kimtech Science 7552
Large Falcon tube centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006-100G
Light microscope Leica DM LS2
L-Ornithine Roth T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-1KG
Microfluidic chip Homemade  PDMS based DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP Sigma-Aldrich A2754-1G
NaCl Supelco 1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer Isogen Life Science ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH Supelco 1.06498.1000
Needles for GUVs Henke-Ject 14-14575 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics Henke-Ject 14-15538 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose Cytiva 17526802
Nigericin Sigma-Aldrich N7143-5MG
Nutator VWR 83007-210
Osmolality meter Gonotec Salmenkipp Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger
Polycarbonate filter Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 355647
Pyranine Acros Organics H1529-1G
Quartz cuvette (black) Hellma Analytics 108B-10-40
Sephadex G-75 resin  GE Healthcare 17-0050-01
Sonicator Sonics Sonics & Materials INC Sonics vibra cell
Syringe filter Sarstedt Filtropur S plus 0.2 0.2 µm
Syringe pump Harvard Apparatus A-42467
Tabletop centrifuge Eppendorf centrifuge 5418
Teflon spacer Homemade  Teflon based 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris PanReac AppliChem A1086.1000
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100 ml
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E
UV lamp Spectroline ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer Jasco V730 spectrophotometer
Valinomycin Sigma-Aldrich V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope Zeiss AxioObserver
β-Casein Sigma Aldrich C5890-500g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
  3. Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
  4. Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
  5. Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
  6. Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
  7. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
  8. Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
  9. Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
  10. Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
  11. Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
  12. Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
  13. Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
  14. Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
  15. Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
  16. Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
  17. Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
  18. Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
  19. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  20. Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
  21. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  22. Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023).
  23. Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
  24. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , Elsevier. 161-176 (2009).
  25. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
  26. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  27. Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
  28. Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
  29. Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
  30. Van'T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
  31. Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
  32. Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
  33. Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
  34. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  35. Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459 (2019).
  36. Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
  38. Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
  39. Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
  40. Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
  41. Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
  42. Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).

Tags

רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בנייה מחדש של חלבוני ממברנה שלפוחיות חד-למלריות גדולות (LUVs) שלפוחיות חד-לאומיות ענקיות (GUV) ביוריאקטורים חיישנים מבוססי פלואורסצנציה אנקפסולציית אנזימים אנקפסולציה מטבוליטית
בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, … More

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, B. Construction of Out-of-Equilibrium Metabolic Networks in Nano- and Micrometer-Sized Vesicles. J. Vis. Exp. (206), e66627, doi:10.3791/66627 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter