Summary
膜タンパク質を再構成し、酵素やその他の水溶性成分をサブマイクロメートルおよびマイクロメートルサイズの脂質小胞にカプセル化するためのプロトコルを提示します。
Abstract
精製されたコンポーネントを使用して、内在性膜タンパク質、酵素、および蛍光ベースのセンサーを含む複雑なタンパク質ネットワークを小胞に組み込む方法を紹介します。この方法は、バイオリアクターの設計と構築、および複雑な非平衡代謝反応ネットワークの研究に関連しています。まず、以前に開発されたプロトコルに従って、(複数の)膜タンパク質を大きな単層小胞(LUV)に再溶解します。次に、精製された酵素、代謝物、および蛍光ベースのセンサー(蛍光タンパク質または色素)の混合物を凍結融解押出しでカプセル化し、遠心分離および/またはサイズ排除クロマトグラフィーによって非組み込み成分を除去します。代謝ネットワークのパフォーマンスは、ATP/ADP比、代謝物濃度、内部pH、または蛍光読み出しによるその他のパラメータを監視することにより、リアルタイムで測定されます。直径100-400 nmの膜タンパク質含有小胞は、既存の最適化された手順を使用して、巨大単層小胞(GUV)に変換できます。このアプローチにより、可溶性成分(酵素、代謝物、センサー)をマイクロメートルサイズの小胞に含めることができるため、バイオリアクターの容量を桁違いに拡大できます。GUVを含む代謝ネットワークは、光学顕微鏡による分析のためにマイクロ流体デバイスに閉じ込められます。
Introduction
ボトムアップ合成生物学の分野は、バイオテクノロジー3,4または生物医学目的5,6,7,8のための(最小限の)細胞1,2および代謝バイオリアクターの構築に焦点を当てています。合成細胞の構築は、研究者が天然環境のものを模倣した明確に定義された条件でタンパク質を研究(膜)することを可能にする独自のプラットフォームを提供し、タンパク質と反応ネットワークの創発的特性と隠された生化学的機能の発見を可能にします9。自律的に機能する合成細胞への中間ステップとして、代謝エネルギー保存、タンパク質および脂質合成、恒常性など、生細胞の本質的な特徴を捉えるモジュールが開発されています。このようなモジュールは、生命に対する理解を高めるだけでなく、医学8やバイオテクノロジー10の分野にも応用できる可能性がある。
膜貫通型タンパク質は、細胞内外で分子を輸送し、シグナルを送り、環境の質に応答し、多くの生合成の役割を果たすため、事実上あらゆる代謝ネットワークの中心にあります。したがって、合成細胞における代謝モジュールのエンジニアリングには、ほとんどの場合、内在性および/または末梢膜タンパク質を、特定の脂質と高い完全性(低透過性)で構成される膜二重層に再構成する必要があります。これらの膜タンパク質の取り扱いは困難であり、特定の知識と実験スキルが必要です。
リン脂質小胞内で膜タンパク質を再構成するためにいくつかの方法が開発されており、最も頻繁には、特定のタンパク質の機能11,12、調節13、速度論的特性14,15、脂質依存性15,16、および/または安定性17を研究する目的で開発されました。これらの方法は、脂質の存在下で界面活性剤可溶性タンパク質を水性媒体に迅速に希釈すること18、界面活性剤可溶化タンパク質を界面活性剤で不安定化した脂質小胞とインキュベートすることによる界面活性剤の除去、および界面活性剤のポリスチレンビーズへの吸収19、または透析またはサイズ排除クロマトグラフィー20による界面活性剤の除去を含む.有機溶媒は、例えば、油-水間相21の形成を介して脂質小胞を形成するために使用されてきたが、内在性膜タンパク質の大部分は、そのような溶媒に曝露されると不活性化される。
当研究室では、主に界面活性剤吸収法により膜タンパク質を再構成し、大単層小胞(LUV)19を形成する。この方法は、複数の膜タンパク質の共再構成および酵素、代謝物、およびプローブの小胞内腔へのカプセル化を可能にする22,23。膜タンパク質含有LUVは、電気形成24またはゲル支援膨潤25のいずれかを使用し、膜タンパク質26の完全性を維持するための特定の条件を用いて、水溶性成分のカプセル化の有無にかかわらず、巨大単層小胞(GUV)に変換することができる。
この論文は、L-アルギニンのL-オルニチンへの分解を通じてATPを再生する非平衡代謝ネットワークのLUVでの再構成のためのプロトコルを提示します27。ATPの形成は、リン脂質合成のための重要な構成要素であるグリセロール-3-リン酸(G3P)の産生と結合している22,28。代謝経路は、アルギニン/オルニチン(ArcD)とG3P/Piアンチポーター(GlpT)の2つの内在性膜タンパク質で構成されています。さらに、ATPのリサイクルには3つの可溶性酵素(ArcA、ArcB、ArcC)が必要であり、GlpKを使用してグリセロールをグリセロール3-リン酸に変換するために使用されます。L-アルギニンの分解からのATPを使用して、経路の概略図の概要については図1を参照してください。このプロトコールは、脂質やタンパク質の合成、または細胞の分裂など、さらに複雑な反応ネットワークを将来構築するための良い出発点となります。小胞の脂質組成は、多種多様な内在性膜タンパク質の活性をサポートし、小胞27,29,30の内外への多様な分子の輸送に最適化されている。
図1:ATP産生およびグリセロール3-リン酸の合成および排泄のための経路の概要。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
要するに、精製された膜タンパク質(ドデシル-β-D-マルトシド、DDMに可溶化)を、Triton X-100で不安定化した予め形成された脂質小胞に添加することで、タンパク質を膜に挿入することができます。その後、活性剤分子は活性ポリスチレンビーズの添加によって(ゆっくりと)除去され、その結果、十分に密封されたプロテオリポソームが形成されます。次に、可溶性成分を小胞に添加し、凍結融解サイクルでカプセル化することで、膜融合の過程で分子を捕捉することができます。得られた小胞は非常に不均一であり、多くは多層です。次に、細孔径が400、200、または100nmのポリカーボネートフィルターを介して押し出され、より均一なサイズの小胞が得られます。細孔サイズが小さいほど、小胞はより均質で単層化されますが、その代償として内部容積が小さくなります。取り込まれていないタンパク質および低分子は、サイズ排除クロマトグラフィーによって外部溶液から除去されます。proteoLUVは、ゲルアシスト膨潤によってマイクロメートルサイズの小胞に変換することができ、これらのproteoGUVは、顕微鏡による特性評価と操作のためにマイクロ流体チップに収集およびトラップされます。 図2 は、完全なプロトコルの概略図の概要を示しています。
図2:サブマイクロメートル(LUV)およびマイクロメートルサイズ(GUV)の脂質小胞に膜タンパク質を再構成し、酵素および水溶性成分をカプセル化するためのプロトコルの概要。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
再構成およびカプセル化プロトコルは良好に機能し、タンパク質の機能は保持されますが、proteoLUVおよびproteoGUVのサイズは不均一です。マイクロ流体アプローチ31,32は、サイズがより均質なマイクロメートルサイズの小胞の形成を可能にするが、二重層内の残留溶媒がタンパク質を不活性化するため、膜タンパク質の機能的再構成は一般に不可能である。proteoLUVのサイズは100〜400 nmの範囲であり、低濃度の酵素では、カプセル化により代謝経路が不完全な小胞につながる可能性があります(確率的効果;図3を参照)。LUVは、ATPやG3Pなどのビルディングブロックの生成にここに示すように、特定の代謝モジュールを構築するのに理想的です。このようなプロテオLUVは、GUVにカプセル化され、宿主小胞のオルガネラ様コンパートメントとして機能する可能性があります。
図3:直径100、200、または400nmの小胞あたりの分子数 (A) カプセル化されたタンパク質(酵素、プローブ)が1〜10 μMの範囲にある場合 (B) 再構成は、脂質(mol/mol)あたり1〜1,000、1〜10,000、および1〜100,000の膜タンパク質で行われます。分子は示された濃度でカプセル化され、これらのタンパク質と脂質の比率で膜に取り込まれると仮定します。一部の酵素では、それらが膜に結合し、小胞内の見かけの濃度を増加させる可能性があることがわかりました。略語:LPR = Lipid-Protein-Ratio この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1. 一般的な準備
- 化学薬品
- 脂質(粉末状)をCHCl3 に25 mg / mLに溶解して、予め形成されたリポソームを作製します。
注:新鮮な脂質ストックを調製することが望ましいですが、ストック溶液は-20°Cで数週間保存することもできます。粉末状の脂質を扱うことは、CHCl3ですでに可溶化された脂質を使用するよりも正確です。CHCl3 はプラスチックを溶解するため 、CHCl 3はガラスピペットおよび/またはシリンジを使用して取り扱い、ガラス容器に保管する必要があります。 - カプセル化手順のために低分子(ヌクレオチド、アミノ酸、蛍光プローブ)を50 mM KPi(バッファーA、 表1を参照)に溶解し、pHを7.00±0.01に調整します。リン酸マグネシウム沈殿物の形成を避けるために、MgCl2 を脱イオン水に溶解します。
注:ストック溶液は、実験日に新たに調製されるDTTを除き、-20°Cで数週間保存できます。 - イオノフォア(例えば、バリノマイシン、ニゲリシン)をDMSOまたはEtOHのいずれかに100〜500μMのストック濃度で溶解し、-20°Cで数週間保存します。蒸発を避けてください。
注:DMSOは揮発性ではないため、EtOHよりも好まれます。プラスチック製のバイアルの代わりにガラスを使用して、バイアルの表面にイオノフォアが付着しないようにします。
- 脂質(粉末状)をCHCl3 に25 mg / mLに溶解して、予め形成されたリポソームを作製します。
- バッファー
- 実験当日に新しいバッファーを調製します(表1)。24時間以上保管しないでください。
- 可溶性タンパク質の精製
- Express ArcA、ArcB、ArcC(ArcC1という名前の特定のバリアントを使用)、PercevalHR、およびGlpKは、前述の27,28,33。細胞溶解バッファーに10% v/vグリセロールを添加すると、タンパク質の安定性が向上します。 27,28,33に記載され、以下でまもなく報告される可溶性タンパク質を精製する。
- 10 mLの細胞溶解物(~5 gの湿重量)を氷水浴で解凍します。その間に、2 mL(1 CV)のNi2+-セファロース樹脂を重力流カラム(容量20 mL)に塗布し、脱イオン水(12 CV)とバッファーB(4 CV)を塗布して洗浄します。解凍したライセートを氷に移します。特に明記されていない限り、氷上で作業します。
- 解凍したライセートにイミダゾールを最終濃度10 mMまで加え、その溶液を重力フローカラムに注ぎます。穏やかな章動で4°Cで1時間インキュベートします。
- 1時間後、流動を捨て、レジンをバッファーC(20CV)で洗浄します。
- バッファーDでタンパク質を溶出し、最初の溶出ステップで60%CVを使用し、続いて40%CVの4-6ステップで溶出します。
- タンパク質濃度を決定し、Na-EDTAを最終濃度5 mMまで添加します。
- 精製したタンパク質を冷蔵卓上遠心分離機(最高速度、10分、4°C)でスピンダウンします。Buffer Eを使用してサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、溶出画分をプールし、カットオフ値が30 kDaの濃縮フィルターで~10 mg/mLに濃縮します。適切なサイズ(~20 μL)のアリコートを調製し、液体窒素で急速凍結し、後で使用するために-80°Cで保存します。
注:カプセル化に必要な量を最小限に抑えるために、酵素を50〜100μMに濃縮することが重要です。
- 膜タンパク質の精製
- ArcDおよびGlpTを前に説明したように過大発現する 22,27,33.必ず10% v/vグリセロールを細胞溶解バッファーに加えてください。ArcDの精製には、バッファーに2 mM還元剤(DTTなど)を含めます。アフィニティータグ付きタンパク質をNi2+-セファロースクロマトグラフィーで精製します。
- 粗膜小胞(全膜タンパク質10〜20 mg)のアリコートを氷水浴で解凍します。
注意: 解凍後は、特に明記されていない限り、常に氷の上で作業してください。このセクションで使用するバッファーについては、 表 1 を参照してください。 - メンブレンベシクルをバッファーF(ArcD)またはバッファーG(GlpT)に添加し、最終容量6 mLにします。サンプルを穏やかなナットで4°Cで1時間インキュベートします。
- 超遠心分離(337,000 × g、30分、4°C)により、可溶化した膜タンパク質を膜破片から分離します。その間に、0.25 mL(1 CV)のNi2+-セファロース樹脂を、脱イオン水(40 CV)と20 CVのバッファーH(ArcD)またはバッファーI(GlpT)を入れた重力フローカラム(容量10 mL)に塗布します。
- 可溶化したタンパク質を重力流カラムに注ぎ、イミダゾールを最終濃度10 mMまで加えます。穏やかな章動で4°Cで1時間インキュベートします。
- 1時間後、フロースルーを廃棄し、20CVのバッファーJ(ArcD)またはバッファーK(GlpT)でレジンを洗浄します。
- Buffer L(ArcD)またはBuffer M(GlpT)を使用して、60% CV(1st)および40% CV(2nd-6 th)ステップでメンブレンタンパク質を溶出します。
- タンパク質濃度を決定し、セクション2.2に進みます。膜の再構成用。
注:サイズ排除精製は、膜再構成が同様の精製をもたらすため、膜タンパク質に対して必ずしも行われるわけではありません。ステップ1.4と2.2は、1日の作業で実行できます。午前中にタンパク質の精製(ステップ1.4)を開始し、午後に再構成(ステップ2.2)を続けます。再構成は翌日に終了します(詳細についてはセクション2.2を参照)。停止ポイント:精製およびDDM可溶化したArcDおよびGlpTは、後で使用するために-80 °Cで保存できますが、これはすべての膜タンパク質に当てはまるわけではありません。適切なサイズ(50〜200μL)のアリコートを調製し、液体窒素で急速凍結し、後で使用するために-80°Cで保存します。これらのタンパク質は、10% v/v グリセロールの存在下で -80 °C で保存すると、数か月間活性を示します。
- 粗膜小胞(全膜タンパク質10〜20 mg)のアリコートを氷水浴で解凍します。
- ArcDおよびGlpTを前に説明したように過大発現する 22,27,33.必ず10% v/vグリセロールを細胞溶解バッファーに加えてください。ArcDの精製には、バッファーに2 mM還元剤(DTTなど)を含めます。アフィニティータグ付きタンパク質をNi2+-セファロースクロマトグラフィーで精製します。
- 不動態化のためのβ-カゼインの調製
- 100 mgのβ-カゼインを20 mLの脱イオン水に再懸濁し、β-カゼインが完全に溶解するまで1 M NaOHで滴定します。.次に、1 M酢酸を加えてpHを7.0に調整し、脱イオン水で容量を50 mLまで満たします。0.2 μmシリンジフィルターで溶液をろ過し、500 μLのアリコートを調製します。
注:β-カゼインは-20°Cで6ヶ月間保存できます。βカゼイン凝集体がマイクロ流体チップを詰まらせるのを防ぐために、使用前にβカゼインを再度ろ過することをお勧めします。
- 100 mgのβ-カゼインを20 mLの脱イオン水に再懸濁し、β-カゼインが完全に溶解するまで1 M NaOHで滴定します。.次に、1 M酢酸を加えてpHを7.0に調整し、脱イオン水で容量を50 mLまで満たします。0.2 μmシリンジフィルターで溶液をろ過し、500 μLのアリコートを調製します。
| バッファ | 組成 | ||
| バッファ A | 50 mM KPi pH 7.0 | ||
| バッファB | 50 mM KPi、100 mM KCl、10% v/v グリセロール、10 mM イミダゾール、pH 7.5 | ||
| バッファC | 50 mM KPi、100 mM KCl、10% v/v グリセロール、50 mM イミダゾール、pH 7.5 | ||
| バッファD | 50 mM KPi、100 mM KCl、10% v/v グリセロール、500 mM イミダゾール、pH 7.5 | ||
| バッファE | 50 mM KPi、100 mM KCl、10% v/v グリセリン、pH 7.0 | ||
| バッファF | 50 mM KPi、100 mM KCl、0.5% w/v DDM、10% v/v グリセロール、2 mM β-メルカプトエタノール、pH 7.5 | ||
| バッファG | 50 mM Tris-HCl、0.5% w/v DDM、20% v/v グリセロール、pH 8 | ||
| バッファH | 50 mM KPi、100 mM KCl、0.02% w/v DDM、10% v/v グリセロール、2 mM β-メルカプトエタノール、10 mM イミダゾール、pH 7.5 | ||
| バッファ I | 50 mM Tris-HCl、0.04% w/v DDM、20% v/v グリセロール、10 mM イミダゾール、pH 8.0 | ||
| バッファJ | 50 mM KPi、200 mM KCl、0.02% w/v DDM、10% v/v グリセロール、2 mM β-メルカプトエタノール、50 mM イミダゾール、pH 7.5 | ||
| バッファK | 50 mM Tris-HCl、0.04% w/v DDM、20% v/v グリセロール、50 mM イミダゾール、pH 8 | ||
| バッファL | 50 mM KPi、200 mM KCl、0.02% w/v DDM、10% v/v グリセロール、2 mM β-メルカプトエタノール、500 mM イミダゾール、pH 7.5 | ||
| バッファーM | 50 mM Tris-HCl、0.04% w/v DDM、20% v/v グリセロール、500 mM イミダゾール、pH 8 | ||
| バッファ N | 50 mM KPi、58 mM NaCl、2 mM DTT、pH 7.0 | ||
| バッファO | 50 mM KPi、0.5 mM L-オルニチン、10 mM Na-ADP、10 mM MgCl2、2 mM DTT、pH 7.0 | ||
| バッファP | 50 mM KPi pH 7.0、2 mM DTT、x mM グルコース (x は外部培地と内部培地の浸透圧に合わせて変化します) | ||
| バッファQ | 50 mM KPi pH 7.0、0.5 mM スクロース、2 mM DTT | ||
| バッファ R | 50 mM KPi pH 7.0、2 mM DTT、10 mM L-アルギニン、x mM グルコース | ||
表 1: このプロトコルで使用されるバッファー。
2. プロテオリポソーム:精製した膜タンパク質を予め形成された脂質小胞に再構成
- 1日目
- 予め形成された脂質小胞の調製
- 脂質組成(合成リン脂質、 大腸菌 極性脂質など)は、膜タンパク質の要件に基づいて選択してください。
注:DOPE、DOPG、DOPC(25:25:50 mol%)の混合物が良い出発点ですが、一部のタンパク質にはステロールまたはカルジオリピンが必要な場合があります。酵母原形質膜タンパク質には、ジオレオイル30の代わりにパルミトイル-オレオイル脂質を含めます。ArcDおよびGlpTの再構成には、DOPE、DOPG、およびDOPC(25:25:50 mol%)の混合物で十分です。 - 目的の脂質(CHCl3に可溶化)を混合し、脂質膜が形成されるまでロータリーエバポレーターでCHCl3 を蒸発させます。脂質を洗浄するには、CHCl3と等量のジエチルエーテルを加えます。ジエチルエーテルを蒸発させ、乾燥脂質膜を得る。
- 脂質フィルムを水性媒体(バッファーA)中の総脂質20 mg / mLに再懸濁します。.総量の半分から始めて、静かに振ってください。次に、脂質を適切なサイズのきれいなチューブまたはボトルに慎重に移します。新鮮なバッファーAをフラスコに加え、残りの脂質を溶解して新しい容器に移す手順を繰り返します。バッファーAを添加して、最終濃度を20 mg/mLにします。
- プローブソニケーターを使用して再懸濁した脂質を超音波処理します。直径6 mmのソニケーターチップには、次のパラメータを使用します:強度4 μm、振幅70%、5 秒オン、45 秒オフ、16サイクル。超音波処理による過熱を避けるために、脂質をEtOHを含む氷水浴に浸します。
- 超音波処理したサンプル(50mLの遠心分離チューブに40mLの容量)を液体窒素で急速凍結し、室温の水浴でサンプルを解凍します。一度繰り返します。次に、リポソームを所望の量で分注します(例:1.5mLのプラスチックチューブに1mLまたは20mgの総脂質)。
停止ポイント: この時点で手続きを停止できます。各アリコートをもう一度急速冷凍し(3回目のサイクル)、液体窒素で最大数か月間保存します。液体窒素が急速に沸騰したときにチューブが爆発するのを防ぐために、チューブの蓋を針で2回突き刺すように注意してください。
- 脂質組成(合成リン脂質、 大腸菌 極性脂質など)は、膜タンパク質の要件に基づいて選択してください。
- 予め形成された脂質小胞の調製
- 2日目
- 精製された膜タンパク質の予め形成されたリポソームへの再構成
- リポソーム1アリコート(総脂質20 mg)を室温の水浴中で解凍します。それまでの間、選択したフィルター(例:ポリカーボネート、細孔径400 nm)を適用して押出機を準備します。押出機をバッファーAで事前に平衡化します。解凍したリポソーム(「乳液」)を押出機にロードし、フィルターに13回通します。押し出されたリポソーム(現在は大きな単層小胞;「不透明な溶液」)を適切なサイズ(例:15mL)のガラスまたはプラスチック容器に入れます。リポソームをバッファーAに2 mM DTTを添加して4 mg/mLに希釈します。
- 1 mLの4 mg / mLリポソームを1 mLの透明キュベットに移します。.分光光度計で、540nmの初期光学密度を測定します。測定したサンプルを注ぎ戻し、50 μL の 10% v/v Triton X-100 をリポソームに加えます。
注:滴定容量50 μLの10% Triton-X100は、5 mLの容量の20 mgの脂質に適しています。Triton X-100を添加すると、脂質が~5%希釈されます。異なる量のリポソームを扱う場合は、滴定量を調整します。安定した光密度信号を得るには、室温でTriton X-100でリポソームを滴定します。 - 手順2.2.1.2を繰り返し、最大光学濃度(Rsat)に達したときに注意してください。光学密度が約60% Rsat に達するまで、滴定をさらに進めます(図4)。洗剤で不安定化した小胞をガラス/プラスチックチューブに戻し(最終容量は約5.2mL)、サンプルを氷に移し、冷まします。
- 精製した膜タンパク質を不安定化したリポソームに添加して、目的の脂質対タンパク質比(w / w)に到達します。400:1 から 100:1 w/w までの比率を使用します。ArcDとGlpTの分子量はどちらも~55 kDaであるため、脂質とタンパク質の比率が400:1 w/wの場合 、タンパク質あたり~30,000個の脂質、直径400 nmの小胞あたりあたり~50分子のArcDとGlpTの分子に相当します。
注:ここでは、脂質20 mgあたり各タンパク質の50 μgに対応する400:1 w / wを使用します 。 - サンプルを4°Cで15分間ヌーテートし、不安定化したリポソームメンブレンにメンブレンタンパク質を挿入します。
- 洗剤を取り除くには、製造元の指示に従って調製した乾燥ポリスチレンビーズ200 mgを追加します。.4°Cでさらに15分間定置します。
注:200 mgの乾燥ビーズの量は20 mgの脂質に適していますが、異なるサンプルサイズを使用する場合は調整する必要があります。 - ステップ2.2.1.6 2xを繰り返し、合計3つのポリスチレンビーズを追加します。その後、穏やかな章動で4°Cで一晩インキュベートします。
- 精製された膜タンパク質の予め形成されたリポソームへの再構成
- 3日目
- 手順2.2.1.6を繰り返します。ただし、今回は4°Cで1時間定動します。
- 空の重力フローカラム(容量10 mL)を空の6.5 mL超遠心チューブの上に氷上に固定します。サンプルをカラムに注ぎ、超遠心チューブにプロテオリポソームを回収します(ビーズはカラムに保持されます)。
- 2 mM DTTを添加した0.5 mLのバッファーAでビーズを洗浄し、濾液を超遠心チューブに集めます。
- 超遠心分離(337,000 × g、30分、4 °C)によりプロテオリポソームを濃縮します。プロテオリポソームを総容量200 μL(100 mgの脂質/ mL)に2 mM DTTを添加したバッファーAに再懸濁します。遠心分離後の小胞の乾燥容量は、~40〜120μLです27。希望のサイズのアリコートに分割します(例:.、総脂質6.66 mgの3つのアリコート)。
注:アリコートのサイズは任意ですが、後のステップでペレットのサイズに影響します(ステップ3.2.3.1を参照)。停止ポイント: ここで手続きを停止できます。各アリコートを急速冷凍し、液体窒素で最大数週間保存します。液体窒素が急速に沸騰したときにチューブが爆発しないように、チューブの蓋を針で2回突き刺すように注意してください。
図4:Triton X-100によるプリフォームリポソームの滴定。 5 mgの脂質/mLのリポソームをポリカーボネートフィルター(400 nm)で50 mM KPi(pH 7.0)で押し出し、Triton X-100で滴定します(プロトコールステップ2.2.1.2)。小胞の濁度はA540で測定されます。矢印は、19で説明したように、膜タンパク質の自発的な挿入のために小胞が十分に不安定になるTriton X-100濃度を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. サブミクロンサイズの小胞におけるATPリサイクルとグリセロール3-P合成のための代謝ネットワークのカプセル化
- 1日目
- ・・成分の混合
- 標準的なカプセル化には、最終容量200 μL(総脂質33.33 mg/mL)で66.6 μLのプロテオリポソームを使用します。目的の濃度に達するために必要な各成分(酵素、補因子)の容量を計算し、これらの成分をプロテオリポソームに添加し、バッファーAで容量を200μLに調整します(表2)。
注:タンパク質濃度は、実験設定に基づいて調整できます。ただし、望ましくない確率的影響を避けるために、各酵素のいくつかのコピー(>10)が小胞ごとに平均して存在するように注意する必要があります。1 μM>濃度は一般的に安全です。直径400 nmの小胞中の1 μMは、約20コピーに相当します(図3)。 - 空に1.5 mLチューブに緩衝液Aをピペットで移し、DTT、Na-ADP、MgCl2、L-オルニチン(および内部pH測定に必要な場合はピラニン)を加えます。次に酵素を加えて優しく混ぜます。予め形成されたプロテオリポソームの上に溶液を加え、低速で短時間ボルテックスします。
注:リン酸マグネシウム沈殿物の望ましくない形成を避けるために、MgCl2 の前にNa-ADPを添加することが重要です。粘性溶液を適切に混合するには、ボルテックスが必要です。ただし、タンパク質への機械的損傷を避けるために、持続時間と速度を最小限に抑えてください。PercevalHRとピラニンは、スペクトルが重なるため、共カプセル化できません。
- 標準的なカプセル化には、最終容量200 μL(総脂質33.33 mg/mL)で66.6 μLのプロテオリポソームを使用します。目的の濃度に達するために必要な各成分(酵素、補因子)の容量を計算し、これらの成分をプロテオリポソームに添加し、バッファーAで容量を200μLに調整します(表2)。
- 内部浸透圧の測定
- ステップ3.1.1.1で説明したように、プロテオリポソームを含まない50 μLの溶液を調製し、凝固点浸透圧計で浸透圧を測定します。
- バッファー(50 mM KPi pH 7.0)とさまざまな濃度の塩(NaCl や NaCl など)または糖を使用して、検量線を調製します。内部浸透圧(Buffer N)に一致する浸透圧濃度を決定します。
注:膜透過性成分(グリセロールなど)は、内部浸透圧に一致するように使用することはできません。グリセロール含有バッファー(バッファーEなど)に可溶化されたタンパク質の場合、同じバッファーをグリセロールなしで使用する必要があります。等浸透圧外部緩衝液の調製のために選択された浸透圧は、膜不透過性であり、代謝ネットワークを妨げないべきである。
- 凍結融解
- プロテオリポソームを可溶性成分とともに瞬間凍結(液体窒素中)し、約10°Cの水氷浴で解凍します。
- 手順3.1.3.1を合計5回繰り返します。
停止ポイント: ここで手続きを停止できます。最後の解凍ステップをスキップし、凍結したサンプルを液体窒素で1〜3日間保存します。液体窒素が急速に沸騰したときにチューブが爆発しないように、チューブの蓋を針で2回突き刺すように注意してください。脂質の酸化を最小限に抑えるために、-80°Cよりも液体窒素での保存が推奨されます。
- ・・成分の混合
- 2日目
- 押し出し
注:ガスタイトシリンジが漏れるため、すべての押出ステップは室温で行われます。- 任意のフィルター(例:ポリカーボネート、細孔径400 nm)を適用して押出機を準備します。小胞のカプセル化に使用したのと同じバッファーと代謝物を含む溶液(例:バッファーOと0.1 mMピラニン)で押出機を洗浄します。
注:ピラニンを含むプロテオリポソームの装填には、色素が押出機の表面に付着し、後のサンプルで汚染を引き起こす可能性があるため、専用の押出機を使用してください。 - カプセル化混合物を押出機にロードし、フィルター13xに通します。押し出した溶液を1.5mLのチューブに集めます。
- 任意のフィルター(例:ポリカーボネート、細孔径400 nm)を適用して押出機を準備します。小胞のカプセル化に使用したのと同じバッファーと代謝物を含む溶液(例:バッファーOと0.1 mMピラニン)で押出機を洗浄します。
- サイズ排除クロマトグラフィー(オプション)
注:このステップは、サイズ排除クロマトグラフィーによってピラニンのような色素などの外部分子を除去するために実行されます。染料がシステムに存在せず、他の成分が低濃度で干渉していない場合(小胞は後で超遠心分離によっても洗浄されることに注意してください)、ステップ3.2.2。スキップできます。- Sephadex G-75樹脂を再水和し、ガラス柱(長さ22 cm、幅1.5 cm)に注ぎます。過剰な外部バッファー(バッファーNなど)で樹脂を平衡化します。
- ステップ 3.2.1.2 で押し出したプロテオリポソームを平衡化済みサイズ排除クロマトグラフィーカラムにロードし、外部バッファーの重力流を適用します。ボイドボリューム(約7 mL)を廃棄します。次に、1 mL アリコートを 10 個集めます。プロテオリポソーム含有アリコートをUVランプに短時間照射して可視化します。ほとんどのプロテオリポソーム(2〜4 mL)を含む画分をプールします。
- 洗浄と再懸濁
- 押し出したプロテオリポソームを超遠心分離で洗浄します。6.5 mLの超遠心チューブに5.8 mLのバッファーNを充填し、押し出したサンプルを上から塗布します。サイズ排除クロマトグラフィーを実施した場合は、プールした溶出サンプル(2〜4 mL)をチューブに充填し、バッファーNを最終容量6 mLまで加えます。
- 337,000 × gで30分、4°Cで遠心分離します。 上清を捨て、ペレットに触れないように注意しながら、ほこりのないティッシュで超遠心チューブを完全に乾かします。ペレットを少量のバッファーN(200 μL)に再懸濁します。ペレットが完全に再懸濁されたら、チューブにバッファーNを最大6 mL充填します。
注:ペレットの再懸濁には時間がかかりますので、慎重に行う必要があります。 - ステップ3.2.3.1-3.2.3.2 2xを繰り返し、合計3回の洗浄を行いますが、サイズ排除クロマトグラフィーを行わない限り(この場合、1回の遠心分離ステップで十分です)。最終的に、適切な量のバッファーNを添加して、ペレットを目的の濃度(例:5.55 mg/mL total lipid)に再懸濁します。
停止点:プロテオリポソームは、すぐに使用することも、4 °Cで少なくとも48時間保存することもできます。超遠心チューブのサイズは、サンプルサイズに基づいて選択する必要があります。総脂質6.66 mgのペレットには、6.5 mLチューブが適切です。200 μL のプロテオリポソーム (合計 33.33 mg/mL、乾燥ペレット容量 ~40 μL)28 を 3 x 6 mL のバッファーに洗浄すると、洗浄ステップごとに外部成分が 100 倍に希釈されます。異なるサイズのチューブを使用する場合は、それに応じて洗浄回数を調整することが望ましいです。
- 押し出し
- 3日目
- 蛍光によるATP合成の検出
- 反応成分を最終容量120 μL(表3)まで混合し、ウィンドウが3 x 5 mm、最小内部容積が100 μLの黒色石英キュベットに入れます。
注:イオノフォアを添加して、電気化学的イオングラジエントを放散することができます。バリノマイシンとニゲリシンの混合物(各1μM)は、プロトンとカリウムの勾配を効果的に消散させます。 - 30°Cに設定した蛍光光度計でサンプルを予温し、PercevalHRの励起スペクトル(励起400-520 nm、帯域幅5 nm、蛍光550 nm、帯域幅5 nm)を取得します。プローブシグナルが一定になったら、過剰なL-アルギニン(5-10 mM)と、ATPのリサイクルがグリセロール3-リン酸の合成に結合している場合はグリセロール(400 μM)を添加して代謝ネットワークを開始します。時間の経過に伴う反応を追跡します。
- 反応成分を最終容量120 μL(表3)まで混合し、ウィンドウが3 x 5 mm、最小内部容積が100 μLの黒色石英キュベットに入れます。
- データ分析
- ATP/ADP比の定性的指標である時間の関数として、F500/F430 の比をプロットします。ATP形成のより定量的な評価のためには、プロテオリポソームの検量線を作成するか、補完的なアプローチ(例えば、化学発光によるATP定量28)を使用してください。
- 蛍光によるATP合成の検出
| コンポーネント | 最終濃度 |
| バッファ A | 50 mM KPi pH 7.0 |
| DTTの | 2 mM |
| NA-ADPの | 10 mM |
| MgCl2 | 10 mM |
| L-オルニチン | 0.5 mM |
| 蛍光プローブ(PercevalHRまたはピラニン) | それぞれ5.8 μMまたは0.1 mM |
| ArcA(アルギニンデイミナーゼ) | 1 μM |
| ArcB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ) | 2 μM |
| ArcC1(カルバメートキナーゼ) | 5 μM |
| GlpK(グリセロールキナーゼ) | 1.6 μM |
| プロテオリポソーム | 総脂質 33.33 mg/mL |
表 2: カプセル化コンポーネント。 コンポーネントは、追加順にリストされています。可溶性タンパク質はバッファーEに含まれています。他のすべての成分(脱イオン水中のMgCl2を除く)はバッファーAに含まれています。
| コンポーネント | 最終濃度 |
| バッファK | 50 mM KPi pH 7.0、58 mM NaCl、2 mM DTT、pH 7.0 |
| プロテオリポソーム(脂質5.55mg/mL) | 脂質 2.7 mg/mL |
| イオノフォア(バリノマイシン、ニゲリシン) | 各1μM |
表3:実験条件。 コンポーネントは、追加順にリストされています。プロテオリポソームはバッファーNに、イオノフォアはDMSOまたはEtOHに存在します。
4. マイクロメートルサイズの小胞のための代謝ネットワークのアップスケーリング
- 1日目
- マイクロ流体チップ調製
注:この実験では、Robinsonらによって開発されたマイクロ流体デバイスを使用しています.34。マイクロ流体チップの他の設計は、35,36,37で利用可能であり、このプロトコルで容易に実装することができる。- 200 μLのピペットチップを下から3分の1にカットし、チップの底部を既製のマイクロ流体トラップデバイスに挿入します。
- チップのインレットリザーバーに、400 μLのβ-カゼイン溶液(2 mg/mL;ステップ1.5を参照)を加え、このステップで空気が入らないように注意してください。96ウェルプレートバケットを置き、卓上コニカルチューブ遠心分離機に実験組織を追加します。チップを組織の上に置いて、900 × g で6分間遠心分離して、マイクロ流体チップの不動態化を可能にします。遠心分離ステップの後、液体レベルはマイクロ流体チップの入口リザーバーと出口先端で等しくなければなりません。チップの漏れがないか確認してください。β-カゼイン溶液をマイクロ流体チップ内で少なくとも30分間インキュベートします。
- 空気を導入せずに不動態化溶液の大部分を除去し、400 μlの洗浄バッファー(バッファーP)を加えます。チップを96ウェルプレートバケットに置き、900 × g で6分間遠心分離します。チップは使用するまで(最大4時間)洗浄液に入れておきます。
- マイクロ流体チップ調製
- プロテオGUV作製のためのゲル調製
注:次の説明は25,38から取得および適応されています。- 0.5%(w / w)の低ゲル化温度(LGT)アガロースをマイクロ波で加熱することにより、脱イオン水に溶解します。アガロースが完全に溶解したことを確認し、溶液を沸騰させないでください。アガロースは、さらに使用するまで50°Cに保ちます。
注:溶解したアガロースは、室温で数週間保存できます。アガロースを再利用するには、電子レンジを使用してゲルを溶かすだけです。 - 2枚の客観的なスライドを取り、スライドにスペーサーの輪郭を描きます。高酸素プラズマを1分間使用して、プラズマ洗浄によりスライドを親水性にします。
- スライドの上にLGTアガロースを、アガロース(~500 μL)で完全に覆われるまで加えます。次に、スライドを90°の角度で傾け、余分なアガロースを組織に排出します。スライドを50°Cで30分間放置します。
- 液体窒素(セクション3)に保存されたプロテオリポソームを採取し、氷上で解凍します。バッファーQを使用して、小胞を5 mg/mLの脂質に希釈します。
注:セクション3で調製したプロテオリポソームは可溶性タンパク質を含まず、液体窒素で保存すれば十分に事前に調製できます。proteoGUVを使用するときは、マイクロ流体デバイスの目詰まりを防ぐために、常に作業溶液をろ過するようにしてください。 - 1 mmプローブを備えたハンドヘルドプローブソニケーターを使用して、プロテオリポソームを超音波処理します。70%の振幅で0.5秒 オン と0.5秒 オフ の10サイクルで超音波処理します。小胞(以下、プロテオSUVと呼ぶ)を氷上に30秒間保持し、超音波処理プロセスを5回繰り返します。
- 100 μLシリンジ(ハンドヘルドLCPディスペンサー内)にproteo-SUVサスペンションを充填します。0.5 μLのプロテオSUV液滴を、あらかじめ調製したアガロースゲルに沈着させます。アガロース層を乱さないように注意し、液滴が融合しないように十分な距離を保つように注意してください。
注:ハンドヘルドLCPディスペンサーを使用すると、再現性のある方法で液滴を堆積させることができますが、別のピペッティングシステムも使用できます。ガラスキャピラリーによるスポッティングは、乾燥したアガロースゲルを乱すため、あまり適していません。 - 圧縮空気の代わりに窒素の流れを使用してSUVの液滴を~10分で乾燥させ、脂質を酸化する可能性を減らします。
- 1.25倍濃縮バッファーO(表4)をバッファーAに1 mL調製し、0.2 μmの酢酸セルロースフィルターを通過させます。1.25倍濃縮溶液800 μLを、 表4に示す濃度まで可溶性酵素とプローブを添加します。ろ過した脱イオン水を使用して、最終容量を1 mLにします。
- タンパク質とグリセロールを除く 表4のすべての成分を含む膨潤溶液100μLを調製します。3点校正された凝固点浸透圧計を使用して、膨潤溶液の浸透圧を測定します。
注:タンパク質とグリセロールを含まない膨潤溶液100μLを調製して、この溶液の浸透圧を正確に測定します。タンパク質溶液中に存在するグリセロールは浸透圧に影響を与えますが、GUVでは、グリセロールは膜全体に急速に拡散し、一時的な浸透圧の違いをもたらすだけです。 - ゲルが入った2つの対物グラスと乾燥したSUVを挟んでGUV膨潤チャンバーを組み立て、厚さ1.5mmまたは3.0mmのテフロンスペーサーを挟みます。次に、シリンジと針を使用して、側面の小さな穴からチャンバー内の膨潤溶液を追加します。
注:膨潤液の量は、スペーサーを1.5mmから3.0mmまで変化させることで調整できます。
- 0.5%(w / w)の低ゲル化温度(LGT)アガロースをマイクロ波で加熱することにより、脱イオン水に溶解します。アガロースが完全に溶解したことを確認し、溶液を沸騰させないでください。アガロースは、さらに使用するまで50°Cに保ちます。
- 小胞の膨潤とGUVの採取
- チャンバーを22°Cに少なくとも30分間置いて、小胞を膨潤させます。
注:タンパク質または脂質が蛍光標識されている場合、小胞の腫脹は光学顕微鏡(例えば、卓上位相コントラスト顕微鏡または広視野蛍光顕微鏡)で追跡することができます。 - 固体表面(例:実験台)でチャンバーを軽くたたくことにより、穏やかな物理的攪拌を適用することにより、ゲルからGUVを回収します。体積の3分の1を取り出し、得られた気泡を使用して残りの液体にゆっくりと動きを誘導し、GUVをゲルから分離します。
- GUVが膨潤している間に、緩衝液Pを調製し、グルコースの濃度を調整して膨潤液と浸透圧を一致させます。0.2 μmシリンジフィルターでバッファーをろ過します。
注:一般に、洗浄液と基質溶液は±5 mosmol/kg以内に保つ必要があります。チップを通過する溶液は、汚染物質がチャネルを詰まらせる可能性があるため、非常にきれいである必要があります。毎回新しいバッファーを作成するか、準備したバッファーを-20°Cで保存し、使用前にろ過します。
- チャンバーを22°Cに少なくとも30分間置いて、小胞を膨潤させます。
- 顕微鏡実験のためのGUVのトラッピング
- 不動態化処理されたマイクロ流体チップを顕微鏡のサンプルステージに取り付けます。考えられる欠陥(漏れ、閉じ込められた空気、チャネルの詰まりなど)がないか確認します。
注意: チップのチェックは、必要に応じて新しいチップを準備できるように、使用する前に十分に行うことができます。 - 曲げた針を使用してチューブをリザーバーの出口に接続し、もう一方の端を1mLシリンジに接続します。シリンジをポンプに取り付け、流量を最大10μL/minに設定します。
- 洗浄バッファーをリザーバーから取り出し(ステップ4.1.1.3)、新しい培地(バッファーP)と交換します。シリンジを介して1〜10μL / minで注入することにより、チップ内のバッファーの流れを開始します。少なくとも80μLの浸透圧バランス洗浄バッファー(Buffer P)で洗浄してください。
- リザーバーから余分な洗浄バッファーを取り除き、(プロテオ)GUVをリザーバーに加えます。流量を0.1〜1μL / minに調整して、GUVがチップ内を流れるようにします。十分な数のGUVがチップに閉じ込められるまで、チップを経時的に監視します。
注:ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジン酸(PA)などの荷電脂質が比較的多量(>20 mol%)の小胞、またはホスファチジルエタノールアミン(PE)などの非二重層形成脂質は、破裂を防ぐためにチップを介して低流量で導入されます。純粋なホスファチジルコリン(PC)で構成される小胞は、より安定している傾向があります。 - 余分なGUV溶液を除去し、0.1-1 μL/minの一定流量を使用して洗浄バッファーPを添加し、外部培地を交換し、トラップされたGUVを少なくとも1時間洗浄して、カプセル化されていない化合物を除去し、蛍光色素がカプセル化されたときのバックグラウンド蛍光を低下させます。バックグラウンド蛍光を経時的に監視します。バックグラウンド蛍光が減少しない場合は、チップがブロックされている可能性があります。
- 十分な量の小胞でトラップの位置を特定し、その位置を保存します。顕微鏡の設定(レーザー強度、ゲイン、波長など)を適用し、時系列実験を開始します。
- 浸透圧バランスのとれた基質溶液(バッファーR)をリザーバーに加え、0.5 μL/minの流速で開始します。
- 不動態化処理されたマイクロ流体チップを顕微鏡のサンプルステージに取り付けます。考えられる欠陥(漏れ、閉じ込められた空気、チャネルの詰まりなど)がないか確認します。
| バッファLコンポーネント | ||
| コンポーネント | 1.25 x 濃度 | 作業集中力 |
| バッファ A | 62.5 mM KPi pH 7.0 | 50 mM KPi pH 7.0 |
| 蔗糖 | 125 mM | 100 mM |
| DTTの | 2.5 mM | 2 mM |
| NA-ADPの | 12.5 mM | 10 mM |
| MgCl2 | 12.5 mM | 10 mM |
| L-オルニチン | 0.625 mM | 0.5 mM |
| カプセル化コンポーネント | ||
| PyranineまたはPercevalHR | 1 mM または 20 μM | |
| ArcA(アルギニンデイミナーゼ) | 1 μM | |
| ArcB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ) | 2 μM | |
| ArcC1(カルバメートキナーゼ) | 5 μM | |
表 4: バッファー O とカプセル化コンポーネント。 コンポーネントは、追加順にリストされています。すべての成分(脱イオン水中のMgCl2を除く)はバッファーAに含まれており、カプセル化成分は添加順にリストされています。すべての水溶性タンパク質はバッファーEに含まれています。
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Representative Results
可溶化膜タンパク質をリポソームに再構成するには、事前に形成された小胞の不安定化が必要です。少量のTriton X-100を添加すると、小胞の膨潤による光散乱の増加により、最初は540 nm(A540)での吸光度が増加します(図4)。A540 の最大値は、リポソームが界面活性剤で飽和する点(Rsat)であり、その後、さらにTriton X-100を添加すると、小胞が部分的に可溶化されます。 Rsolでは、 リポソームは完全に可溶化されます(図4)。膜タンパク質の再構成には、通常、 Rsat (矢印)を超えて60%に不安定化された小胞を使用します。
再構成された膜タンパク質ArcDは、L-アルギニンを小胞に輸送し、L-オルニチンを小胞から輸送するために使用され、カプセル化された酵素ArcA、ArcB、およびArcCとともに、ADPおよび無機リン酸塩からATPをリサイクルするために使用されます。GlpTは、グリセロール3-リン酸/リン酸アンチポーターであり、GlpKとともに、グリセロールとL-アルギニンの分解によって生成されたATPからのグリセロール3-リン酸の合成(および排泄)に必要です。 t = 0 で5mM L-アルギニンをプロテオリポソームに添加すると、500nmおよび430nmの励起39でのPercevalHR蛍光の比が急激に増加し、これは小胞内のATP/ADP比を反映している(図5)。グリセロールを添加すると、ATPはグリセロール3-リン酸の合成に使用され、その結果、ATP/ADP比が低下する28。L-アルギニンの分解はpHの変化にもつながり、これはピラニンまたはpHluorin27を使用して定量化できます。
図5:L-アルギニン分解経路によるATPのリサイクル。 2.7 mg の脂質/mL の LUV をキュベットに入れ、500 nm と 430 nm の蛍光比を記録します。5 mMのL-アルギニンが t = 0で添加されます。F500/F430 比は、小胞内のATP/ADP比の尺度です。略語:LUVs =大単層小胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ATPを生成するLUVは、GUVの形成にも使用できます。LGTアガロースゲル上で乾燥したプロテオLUVを再水和すると、マイクロメートルサイズの小胞が形成されます(図6)。乾燥したLUVスポット内でのプロテオGUVの形成は、脂質の局所濃度と脱水の程度に大きく依存します。一部の地域ではGUVの大きなパッチがありますが、同じ液滴内の他の場所では、GUVがまったく形成されないか、ほとんど形成されません。LGTアガロース支援腫脹によるGUVの形成は、通常、数マイクロメートルから50μm以上の範囲のGUVサイズをもたらします。
図6:ゲルアシスト膨潤によって形成されたproteoGUVのDIC画像。 スケールバー = 25 μm。略語:DIC =微分干渉コントラスト;GUVs = 巨大-単層小胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
GUVは回収され、βカゼイン不動態化PDMSベースのマイクロ流体デバイスに閉じ込められます(図7)。このデバイスは、1回の実験で多くの小胞を捕捉して分析できるように設計されており、デバイスを使用して外部環境(流量、バッファー組成など)を制御します34. プロテオGUVの収率が低い場合でも、マイクロ流体チップを通るGUVの一定の流れにより、多くの小胞を収集することができます。十分な量のGUVが捕捉されたら、浸透圧バランスのとれたバッファーでシステムを洗浄し、可溶性タンパク質、低分子、蛍光プローブなどの外部成分を除去します。次に、洗浄バッファーを、50 mM KPi(pH 7.0)、さまざまな量のグルコース(浸透圧を調整するため)、および10 mM L-アルギニンなどの基質を含む等しい浸透圧の基質溶液で置き換えます。マイクロ流体チップのいくつかのトラップで時系列実験が行われ、画像は90秒ごとに撮影されます(PercevalHRを使用した場合は405nmおよび488nmの励起)。また、各時点において明視野画像が撮影される。488 nmと405 nmでの励起後の発光強度の比は、小胞内のADP / ATP比の尺度です。
図7:マイクロ流体チップによる小胞の捕捉 (A)外部環境と流量を制御する能力を伴う小胞の捕捉。(B)マイクロ流体デバイスにトラップされ、405nmレーザー(緑)と488レーザー(赤)で励起されたProteoGUV。両方のチャネルの発光は>500nmで測定されます。明視野画像により、蛍光を使わずに小胞を可視化することができます。スケールバー = 25 μm。略語:GUVs =巨大-単層小胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
サブマイクロメートルサイズの脂質小胞を含む(膜)タンパク質(proteoLUV)の合成、およびproteoLUVの巨大単層小胞(proteoGUV)への変換のためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、他の膜タンパク質13,19,30,40の再構成、およびここに提示されているL-アルギニン分解およびグリセロール3-リン酸合成経路以外の代謝ネットワークのカプセル化に適用できるはずです。
リポソーム中の膜タンパク質の再構成は、一般に、脂質膜内のタンパク質のランダムな配向をもたらす。ArcDおよびGlptの場合、タンパク質は双方向に作用し、溶質は全電気化学ポテンシャルの符号に応じて移動するため、配向は重要ではありません。一方向に機能するタンパク質の場合、分子の向きが50/50の場合、分子の半分は活性に利用できません。
ポリカーボネートフィルターを介して小胞を押し出しると、サイズ分布が狭くなり、フィルターの細孔サイズが小さくなるほど小胞はより均一になります。ただし、小胞が小さいと、体積が小さくなり、小胞あたりのタンパク質(酵素、膜タンパク質)の数が非常に少なくなります。1つ以上の成分が欠落しているLUVの割合を最小限に抑えるために、タンパク質の濃度を 図3A、B に示すように調整することができますが、非常に小さな小胞では確率的影響が避けられません。
ゲル支援膨潤法は、乾燥したアガロース表面に超音波処理された小胞(SUV)を沈着させることに依存しています。乾燥プロセス中に、小胞の濃度勾配が形成され、脂質濃度はスポットの周辺で最も高くなります。これは、コーヒーステイン効果41,42として知られる現象によるものです。その結果、スポット内の小さな領域にのみ、GUV形成に適した脂質が濃縮されています。円形の不均一な濃度の脂質スポットは、小胞融合に利用できない大きな未使用領域をもたらします。したがって、このアプローチではGUV形成の効率は低くなります。GUVの収率を増加させるためには、スピンコーティング42またはコーヒーステイン効果41を活用することにより達成できる均一な脂質沈着を目指すべきである。
プロトコルに関するその他の注意事項:
確率的影響を避けるために、いくつかの膜タンパク質(>10)が小胞ごとに平均して再構成されるように注意する必要があります。したがって、脂質とタンパク質の比率が400:1 w/wを超えることは避けてください。ほとんどのタンパク質では、ランダムな配向が想定されています。
理想的には、全膜タンパク質の体積はできるだけ小さく、とにかくリポソーム体積の10〜20%を超えないようにします。より大きな容量を追加すると、より多くの界面活性剤が導入され、事前に形成されたリポソームの大部分が溶解する可能性があり、再構成効率に悪影響を与える可能性があります。
カプセル化中のコンポーネントの希釈を避けるために、押出機を適切な溶液で事前に平衡化することが重要です。理想的には、予備平衡化溶液には可溶性酵素も含まれている必要がありますが、押出機の予備平衡化に必要な量が比較的多いため、酵素を含めるとコストがかかりすぎる可能性があります。したがって、通常、これらの成分を省略し、酵素の5%希釈を受け入れます。
プロテオリポソームを含む混合物には、分子が疎水性が高く、小胞が存在しない場合に表面に吸着する可能性があるため、イオノフォアを添加する必要があります。溶媒の添加量が少ない(全反応量の<1%)ので注意が必要です。溶媒が小胞内の代謝ネットワークに影響を与えないことを確認するために、制御が行われます。約 1 μM のイオノフォア濃度は、一般に、~3 mg/mL の総脂質濃度に対して安全です。
液滴を完全に乾燥させるように注意する必要があります。液滴が十分に乾燥していないと、膨潤液を添加すると脂質が脂質凝集体を形成し、MLVが形成されるため、GUV形成の効率が低下します。
グルコースは、外部の浸透圧を内部媒体に一致させるために使用されます。後者にはグルコースの代わりにスクロースが含まれており、小胞の密度を高め、それによってGUVの沈降を促進します。さらに、外部環境中のグルコースは位相差を強め、小胞をより見やすくします。
確率的効果は、GUVではそれほど問題になりません。しかし、ここでは、表面と体積の比率が許容できないほど低くなり、膜タンパク質(トランスポーターなど)の数が内部代謝ネットワークにとって制限的になる可能性があります。このプロトコルに記載されている方法では、proteoGUVのサイズを正確に制御することはできませんが、大部分は5〜50μmのサイズ範囲に収まります。
結論として、ここで紹介する研究は、さまざまなサイズの脂質小胞における膜タンパク質の再構成と酵素カプセル化の包括的な概要を提供します。私たちは、ATPの合成のための機能小胞の構築と、アミノ酸やグリセロールなどの単純な前駆体からのビルディングブロックを実証しています。GUVにおける膜タンパク質の再構成は依然として困難ですが、ここで紹介するプロトコールは、ボトムアップ合成生物学研究のさらなる発展への道を開くものです。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、pBAD-PercevalHR遺伝子のクローニングを行ったAditya Iyer氏と、タンパク質の産生と精製を支援してくれたGea Schuurman-Wolters氏に感謝しています。この研究は、NWO重力プログラム「合成細胞の構築」(BaSyC)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9414-25g | |
| Amicon cut-off filter | Sigma Aldrich | Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra | |
| BioBeads | BioRad | 152-3920 | |
| CHCl3 | Macron Fine Chemicals | MFCD00000826 | |
| D(+)-Glucose | Formedium | - | |
| D(+)-Sucrose | Formedium | - | |
| DDM | Glycon | D97002 -C | |
| Diethyl Ether | Biosolve | 52805 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855-100ml | |
| DOPC | Avanti | 850375P-1g | |
| DOPE | Avanti | 850725P-1g | |
| DOPG | Avanti | 840475P-1g | |
| DTT | Formedium | DTT005 | |
| EtOH | J.T.Baker Avantor | MFCD00003568 | |
| Extruder | Avestin Inc | LF-1 | |
| Fluorimeter | Jasco | Spectrofluorometer FP-8300 | |
| Glycerol | BOOM | 51171608 | |
| Gravity flow column | Bio-Rad | 732-1010 | |
| Hamilton syringe 100 µL | Hamilton | 7656-01 | |
| Hamilton syringe 1000 µL | Hamilton | 81320 | |
| Handheld LCP dispenser | Art Robbins Instruments | 620-411-00 | |
| Handheld Sonicator | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | |
| HCl | BOOM | x76021889.1000 | |
| Imidazole | Roth | X998.4-250g | |
| K2HPO4 | Supelco | 1.05099.1000 | |
| KCl | BOOM | 76028270.1 | |
| KH2PO4 | Supelco | 1.04873.1000 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 7552 | |
| Large Falcon tube centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006-100G | |
| Light microscope | Leica | DM LS2 | |
| L-Ornithine | Roth | T204.1 | |
| LSM Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 ConfoCor 3 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-1KG | |
| Microfluidic chip | Homemade | PDMS based | DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J |
| Na-ADP | Sigma-Aldrich | A2754-1G | |
| NaCl | Supelco | 1.06404.1000 | |
| Nanodrop Spectrometer | Isogen Life Science | ND-1000 spectrophotometer NanoDrop | |
| NaOH | Supelco | 1.06498.1000 | |
| Needles for GUVs | Henke-Ject | 14-14575 | 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm |
| Needles for microfluidics | Henke-Ject | 14-15538 | 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm |
| Ni2+ Sepharose | Cytiva | 17526802 | |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143-5MG | |
| Nutator | VWR | 83007-210 | |
| Osmolality meter | Gonotec Salmenkipp | Osmomat 3000 basic freezing point osmometer | |
| Plasmacleaner | Plasma Etch | PE-Avenger | |
| Polycarbonate filter | Cytiva Whatman | Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 | 0.4 µm |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 355647 | |
| Pyranine | Acros Organics | H1529-1G | |
| Quartz cuvette (black) | Hellma Analytics | 108B-10-40 | |
| Sephadex G-75 resin | GE Healthcare | 17-0050-01 | |
| Sonicator | Sonics Sonics & Materials INC | Sonics vibra cell | |
| Syringe filter | Sarstedt | Filtropur S plus 0.2 | 0.2 µm |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | A-42467 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | centrifuge 5418 | |
| Teflon spacer | Homemade | Teflon based | 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086.1000 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100 ml | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima Max-E | |
| UV lamp | Spectroline | ENB-280C/FE | |
| UV/VIS Spectrometer | Jasco | V730 spectrophotometer | |
| Valinomycin | Sigma-Aldrich | V0627-10MG | |
| Widefield fluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver | |
| β-Casein | Sigma Aldrich | C5890-500g |
References
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