Summary
Aquí proporcionamos un protocolo completo para estandarizar e implementar el método de detección del virus SARS-CoV-2 en muestras humanas mediante amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP). Este método, realizado en 60 minutos, podría adaptarse a cualquier laboratorio o punto de atención a un bajo costo y utilizando equipos económicos.
Abstract
El virus del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2) ha tenido un impacto drástico en la salud humana. Sigue siendo una amenaza para la sociedad moderna porque muchas personas mueren como resultado de la infección. La enfermedad se diagnostica mediante pruebas serológicas y moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR). Este último tiene varias desventajas porque requiere infraestructura especializada, equipos costosos y personal capacitado. En este artículo, presentamos un protocolo que describe los pasos necesarios para detectar el virus SARS-CoV-2 mediante la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) en muestras humanas. El protocolo incluye instrucciones para el diseño de cebadores in silico, la preparación de reactivos, la amplificación y la visualización. Una vez estandarizado, este método puede implementarse fácilmente y adaptarse a cualquier laboratorio o punto de atención en 60 minutos a un bajo costo y utilizando equipos económicos. Es adaptable para detectar diferentes patógenos. Por lo tanto, potencialmente puede ser utilizado en el campo y en los centros de salud para realizar una vigilancia epidemiológica oportuna.
Introduction
El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2) causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). La Organización Mundial de la Salud declaró una emergencia de salud pública de importancia internacional el 30 de enero de 2020 y una pandemia el 11 de marzo de 2020. La pandemia provocó más de 760 millones de casos y 6,87 millones de muertes hasta la fecha de redacción de este artículo1.
El impacto de este virus ha puesto de manifiesto la necesidad de contar con herramientas de vigilancia mejores, más precisas, más rápidas y más ampliamente disponibles para mejorar la detección y el control de las enfermedades infecciosas 2,3. Durante la pandemia, las pruebas diagnósticas del SARS-CoV-2 se basaron en la detección de ácido nucleico, anticuerpos y proteínas, pero la detección por RT-PCR de ácido nucleico es el estándar de oro4. Sin embargo, la RT-PCR tiene algunas limitaciones; Requiere equipos especializados, infraestructura y personal capacitado en biología molecular, limitando su aplicación a laboratorios especializados. Además, requiere mucho tiempo (4-6 h), sin incluir el tiempo de transporte de las muestras al laboratorio, que puede llevardías 5. Estas limitaciones impiden el procesamiento eficiente de las muestras y la obtención de la información necesaria para la planificación de contingencias y la gestión epidemiológica.
La amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) tiene varias ventajas sobre la RT-PCR, lo que la convierte en una estrategia atractiva para el diseño de futuras pruebas diagnósticas en el punto de atención (POCT), especialmente en entornos con recursos limitados6. En primer lugar, es muy específico porque utiliza entre cuatro y seis cebadores que reconocen de seis a ocho áreas de la secuencia diana, ya sea ADN o ARN 7,8. En segundo lugar, debido a que funciona a una temperatura constante, no requiere equipos sofisticados como termocicladores en tiempo real para generar la amplificación, ni requiere personal altamente capacitado para operarlo. En tercer lugar, el tiempo de reacción es muy corto (~60 min) y se emplean reactivos poco especializados, lo que lo convierte en una herramienta rentable6. Teniendo en cuenta lo anterior y la emergencia sanitaria provocada por la pandemia de COVID-19, esta técnica puede ser vista como un método diagnóstico alternativo, rápido, económico y sencillo de implementar en cualquier laboratorio de investigación9.
En este artículo se describe el protocolo para estandarizar e implementar un RT-LAMP para detectar el SARS-CoV-2 por métodos colorimétricos utilizando un termociclador y un baño de agua (Figura 1). Se discuten los puntos críticos, sus limitaciones y las alternativas para avanzarlos.
Figura 1: Esquema del protocolo de amplificación del SARS-CoV-2 mediante la técnica RT-LAMP. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
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Protocol
Las muestras utilizadas fueron proporcionadas por el laboratorio clínico del Hospital Universitario Fundación Valle del Lili y correspondieron al ARN purificado de pacientes que dieron positivo a COVID-19 mediante la técnica RT-qPCR. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para la investigación, y este estudio fue aprobado por el comité de bioética para estudios en humanos del hospital universitario Fundación Valle del Lili.
1. Diseño y preparación de la imprimación RT-LAMP
NOTA: Los cebadores LAMP se pueden utilizar con una variedad de plataformas, incluidas LAMP de New England BioLabs (NEB), Primer Explorer y análisis versátil de ensayo LAMP (LAVA). Sin embargo, para este protocolo, se utilizó la herramienta NEB LAMP. El diseño del cebador se puede realizar utilizando genomas del SARS-CoV-2 obtenidos de la base de datos NextStrain10. En la Tabla 1 se muestra el conjunto de cebadores utilizados en este protocolo.
- Diseño de imprimación para LAMP
- Obtener secuencias del genoma viral.
- Realice alineaciones de secuencia para obtener la secuencia de consenso.
- Navegue hasta la plataforma11 de la herramienta de diseño de cebadores NEB LAMP y siga las instrucciones de la guía rápida. Esta herramienta produce los mismos resultados que el explorador de cebador V5, pero es mucho más fácil de usar en su salida. Utilice los manuales de usuario del explorador de imprimaciones como guía para el diseño de imprimaciones.
- Evaluación termodinámica del conjunto de cebadores
- Utilice la herramienta Imprimación-Dímero12 para realizar un análisis termodinámico de los cebadores obtenidos.
- Coloque las secuencias de cebadores en la herramienta. A continuación, seleccione la opción Análisis múltiplex e informe de estructura de dímeros.
- Seleccione los juegos de cebadores que tengan un ΔG no inferior a -5.
- Evaluación de la especificidad de los cebadores diseñados
- Utilice la base de datos de colección de nucleótidos (nt/nt) de BLAST13 para analizar cada cebador.
- Para realizar el primer análisis BLAST, seleccione la Base de Datos Refseq_rna y filtre la búsqueda con el grupo de géneros que pertenecen a la subfamilia Orthocoronavirinae. Se trata de Alphacoronavirus (taxid:693996), Gammacoronavirus (taxid:694013) y Deltacoronavirus (taxid:1159901). Además, evalúe la secuencia frente a otros virus que circulan simultáneamente como el subtipo H1N1 (taxid:114727), el virus de la influenza A (taxid:11320) y el virus de la influenza B (taxid:11520).
- Para realizar el segundo análisis BLAST, seleccione el GenBank de Betacoronavirus y filtre la búsqueda con Coronaviridae (taxid:11118) y SARS (taxid:694009). Estos grupos contienen secuencias de todos los genomas identificados del coronavirus SARS, incluidos los genomas encontrados en murciélagos, Betacoronavirus (taxid:694002).
- Para este protocolo, asegúrese de que los cebadores no se alineen con genomas que no sean el genoma objetivo, el SARS-CoV-2.
- Preparación de la imprimación
- Centrifugar los viales que contienen los cebadores iyofilizados con una microcentrífuga (10.000 x g, 1 min a temperatura ambiente [RT]) para evitar pérdidas durante la apertura del tubo.
- Rehidratar el polvo iyofilizado en agua de pirocarbonato de dietilo (DEPC) al 0,1% o agua libre de nucleasas hasta una concentración final de 100 μM (Tabla 2) y disolver completamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, centrifugar a máxima velocidad (10.000 x g, 1 min en RT) en una microcentrífuga para recoger todas las soluciones de cebador en el fondo del tubo.
- Prepare la mezcla de imprimación 10x debajo de una cabina de bioseguridad con la imprimación interna directa (FIP), la imprimación interna trasera (BIP), la imprimación exterior delantera (F3), la imprimación exterior trasera (B3), el ciclo hacia atrás (LB) y la imprimación de bucle hacia adelante (LF), como se informa en la Tabla 2. Para evitar pérdidas, pipetee o agite suavemente la solución del cebador antes de realizar un centrifugado rápido (10.000 x g, 1 min en RT) con una microcentrífuga.
- Almacene la mezcla de cebador 10x a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo; Sin embargo, prepárese lo suficiente para un máximo de cinco experimentos, independientemente de varias muestras, para evitar demasiados ciclos de congelación y descongelación.
NOTA Si se necesita un volumen menor de la mezcla de cebadores, ajuste los valores calculando los nuevos volúmenes (Tabla 2). Además, los conjuntos RdRp y RdRp/Hel no incluyen el cebador LF porque los cebadores de bucle no son necesarios para las reacciones RT-LAMP. Como resultado, reemplace el volumen de cebador LF con agua libre de nucleasas o agua DEPC al 0,1%.
2. Reacción RT-LAMP
- Encienda la cabina de flujo laminar de acuerdo con las instrucciones del fabricante y espere al menos 3 minutos para que el flujo de aire se estabilice.
- Una vez que el flujo de aire sea estable, limpie y desinfecte las superficies internas del gabinete utilizando una técnica aséptica. Para lograr esto, use los siguientes desinfectantes en este orden: 1000 ppm de amonio cuaternario (cloruro de benzalconio), 2% de hipoclorito, 3% de peróxido de hidrógeno y 70% de etanol.
NOTA: En este caso, la técnica aséptica consiste en aplicar el desinfectante y retirarlo con servilletas desde el interior de la cabina hacia el exterior sin pasar por superficies previamente limpias. - Utilizando los desinfectantes del paso 2.2, limpie los materiales que entrarán en la cabina en el mismo orden.
NOTA: Se deben introducir en el armario micropipetas, cajas de puntas de filtro, matraces con tubos de 1,5 mL y 0,6 mL, tubos de PCR de 0,2 mL, gradillas y un vaso de precipitados de 400 mL. - Traiga algunas servilletas y guantes de nitrilo a la cabina. Después de eso, apague el gabinete y expóngalo a la luz ultravioleta (UV) durante 15 minutos.
PRECAUCIÓN: Para evitar daños en los tejidos y el ADN por la exposición prolongada a la radiación, evite la luz ultravioleta hasta que expire el tiempo establecido en el paso 2.4.
NOTA Realice el montaje que se muestra en la Figura 2 antes de comenzar el protocolo y comience el baño de agua después de completar el paso 2.4. Es crucial llenar el recipiente metálico casi hasta el borde con agua potable y ajustar la temperatura de la placa calefactora de laboratorio de hierro a 90 °C, ya que esto dará como resultado una temperatura de ~66,3 °C en el sistema, que se controla con el termómetro de mercurio. - Una vez finalizado el período de irradiación, reinicie el armario y siga las recomendaciones del paso 1.1.
- Coloque los reactivos (Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5) en una hielera llena de hielo o en un pequeño refrigerador de poliestireno. Coloque el recipiente dentro del gabinete después de limpiarlo con etanol al 70%.
- En un tubo de microcentrífuga de 0,6 mL, prepare la mezcla LAMP del gen a amplificar (RdRp, N-A y RdRp/Hel), añadiendo solo los siguientes componentes: 10x Tampón, MgSO4, dNTPs, 1x mezcla de cebadores y agua libre de nucleasas o 0,1% de agua DEPC; Mezclar bien pipeteando para homogeneizar.
PRECAUCIÓN: Debido a la manipulación y el comportamiento inadecuados dentro del armario, existe un alto riesgo de contaminación del reactivo. Se deben seguir las siguientes reglas para mitigar este problema: (i) utilizar puntas estériles y de filtro; ii) utilizar una punta para cada reactivo; (iii) moverse lenta y cuidadosamente para evitar interrumpir el flujo laminar; (iv) mantener el orden y utilizar la menor cantidad de materiales; y (v) utilizar diferentes guantes para preparar la mezcla y añadir el material genético.
NOTA: Mantenga todos los reactivos, especialmente las enzimas, en hielo porque los cambios de temperatura pueden desnaturalizarlos y alterar la actividad de la polimerasa. - Coloque el tubo o los tubos de 0,6 ml con el tapón cerrado en un bloque calefactor e incube a 95 °C durante 5 min.
NOTA: Encienda el bloque calefactor para tubos de 1,5-2,0 mL ubicados fuera del gabinete durante al menos 30 minutos antes de comenzar la preparación de la mezcla LAMP y controle la temperatura (95 °C) con un termómetro de mercurio o alcohol. - Cuando se complete la incubación, coloque los tubos en un enfriador de poliestireno lleno de hielo durante 5 minutos.
- Regrese los tubos a la cabina de flujo laminar y complete la preparación de la mezcla LAMP agregando las enzimas ADN polimerasa (Bst 3.0), transcriptasa inversa y ADN polimerasa de alta fidelidad (Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5). En el caso de utilizar detección colorimétrica, añadir el colorante azul de hidroxinaftol (HNB).
- Después de agregar estos reactivos, mezcle muy bien los reactivos LAMP pipeteándolos para solubilizar las enzimas y el colorante.
- Llene cada tubo de PCR con 22,0 μL de la mezcla, teniendo cuidado de no crear burbujas. A continuación, añada 3,0 μL de agua con DEPC al 0,1% o agua libre de nucleasas al control negativo o al tubo sin control de plantilla (NTC) y reserve los tubos restantes para la adición (material genético).
NOTA: Mantenga los tubos de PCR en un enfriador lleno de hielo hasta que se agregue la muestra para evitar activar la enzima Bst 3.0 y comenzar la reacción prematuramente. - Retire todos los materiales del gabinete y use etanol al 70% para limpiar las superficies. A continuación, apáguelo siguiendo las instrucciones del fabricante.
- En un área separada, agregue 3 μL de la muestra a cada tubo de PCR y homogeneícelo completamente. Para ello, utilice una micropipeta de 20 μL y puntas de filtro.
ATENCIÓN: La micropipeta utilizada para añadir el material genético debe utilizarse exclusivamente para este fin y no se puede utilizar para preparar la mezcla. De esta manera, se evita la contaminación de los reactivos. Además, mantenga las muestras de ARN en el hielo en todo momento para reducir la posibilidad de degradación del ARN. Utilice el siguiente equipo de protección personal (EPP) para la adición de la muestra: bata desechable, gorro, mascarilla N95, mallas, gafas de laboratorio y guantes de nitrilo. - Antes de realizar la reacción colorimétrica, tome fotografías de los tubos de PCR con una cámara de alta calidad. El color inicial de HNB es el violeta.
- Realizar la reacción en el siguiente sistema o equipo: (i) termociclador y (ii) baño maría.
- Termociclador: Depositar los tubos en el bloque de reacción y colocar el termoperfil (ver Tabla 6) en el equipo.
- Baño María: Deposita los tubos en recipientes circulares y ajústalos muy bien para evitar que se salgan. Después de eso, coloque los recipientes en el baño de agua (Figura 2A, B) a la temperatura indicada en la Tabla 6.
- En el caso del baño maría, una vez que los tubos están dentro del sistema, inicie el temporizador durante 60 min (Tabla 6).
- Retire los tubos del termociclador o baño de agua después del tiempo de reacción y guárdelos a 4 °C para el funcionamiento electroforético o a -20 °C hasta su uso.
- Si se realizó una reacción colorimétrica, tome fotografías de los tubos de PCR con una cámara de alta calidad. El color final con HNB es azul cielo.
3. Análisis de productos de amplificación en gel de agarosa
NOTA: Estos pasos se sugieren como comprobaciones adicionales a la reacción colorimétrica o control del rendimiento durante la etapa de estandarización. Esto se debe a que la técnica podría presentar un gran riesgo de contaminación para el laboratorio que realiza estas pruebas.
- Coloque el lecho dentro de la cámara de electroforesis de modo que las gomas de los bordes toquen las paredes, creando un espacio sellado para la adición de agarosa (cámara interna) (Figura 3A, B).
- Después de completar el paso 3.1, pese la cantidad necesaria de agarosa en un vaso de precipitados de 500 ml para obtener un gel al 2%. Después de eso, agregue el volumen requerido de tampón de trisacetato EDTA (TAE) 0.5x y cocine en el microondas durante 1-2 minutos.
NOTA: La agarosa se derrite completamente cuando está translúcida y sin grumos cuando se retira del horno. Si esto no se confirma, pueden quedar regiones mal gelificadas, lo que hace que se altere el funcionamiento electroforético y la visualización de los productos de amplificación. - Saca el vaso del horno y vierte la agarosa en la cámara interna creada en el paso 3.1 (Figura 3C). Posteriormente, comprueba que no haya burbujas, y si las hay, retíralas con la punta de una micropipeta.
- Coloque el peine para formar los pocillos y deje que la agarosa se gelifique durante unos 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Pasado este tiempo, añadir 5 mL de tampón TAE 0,5x para facilitar la retirada de los peines y del lecho que contiene el gel. A continuación, coloque el gel de tal manera que los pocillos queden en el ánodo (Figura 3D).
- Llene la cámara de electroforesis con tampón TAE 0,5x hasta la capacidad especificada por el fabricante, asegurándose de que los electrodos estén en contacto con el tampón.
- Agregue 3 μL de marcador de peso molecular al primer pocillo del gel y agregue 9 μL de NTC y cada muestra a los pocillos siguientes. Hágalos combinando 7 μL del producto de amplificación con 3 μL de tampón de carga; luego cargue 9 μL de esta mezcla en los pocillos del gel.
- Cubra la cámara de electroforesis con la tapa y conecte los cables a los puertos de la fuente de alimentación en el patrón de color. Ajuste la fuente de alimentación a los siguientes parámetros: 100 V y amperaje constante durante 120 min.
- Una vez finalizada la ejecución electroforética, coloque el gel en el recipiente con la solución de tinción (bromuro de etidio) e incube durante 30 minutos.
- Después de la incubación, retire el gel de la solución de tinción y colóquelo en una bolsa con cierre hermético. Esto evita la contaminación del equipo que se utilizará para visualizar los amplicones.
- Visualice el gel en un transiluminador o generador de imágenes como el Amersham Imager 600.
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Representative Results
La implementación del protocolo comienza con el diseño del conjunto de cebadores para cada gen diana siguiendo el protocolo descrito anteriormente. En junio de 2020 se obtuvieron 5.000 genomas de SARS-CoV-2 de la base de datos NextStrain, con una representatividad del 10% de los genomas colombianos. Estas secuencias se alinearon para obtener la secuencia de consenso que se utilizó en el proceso de diseño del cebador. En la Tabla 1 se muestra el conjunto de cebadores elegido para los cebadores RdRp/Hel y RdRp. El conjunto de cebadores para la amplificación del gen N se obtuvo de un informe publicado previamente14.
El primer paso en la estandarización del protocolo fue evitar la amplificación NTC. Uno de los parámetros más importantes que se deben verificar en este sentido es determinar la temperatura óptima de fusión (Tm) y la concentración de Bst 3.0 para el conjunto de cebadores. Se utilizó un gradiente de temperatura para determinar la mejor Tm para la amplificación (Figura 4A). Para el conjunto de cebadores utilizados en este protocolo, la Tm óptima fue de 66,3 °C (Figura 4A). Además, se evaluaron diferentes concentraciones de la enzima Bst 3.0, siendo 3.2 lU/μL la concentración óptima para esa reacción (Figura 4B). Las concentraciones proporcionadas por Lu et al.15 se utilizaron para el resto de reactivos (Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5).
Una vez determinada la concentración óptima de Tm y Bst 3.0, se llevó a cabo el proceso de amplificación. Las muestras de los pacientes fueron proporcionadas por el Hospital Universitario Fundación Valle del Lili. Las muestras positivas y negativas se amplificaron previamente utilizando un protocolo convencional de RT-PCR, y el ARN viral se utilizó para la amplificación de RT-LAMP utilizando el protocolo descrito aquí y las condiciones enumeradas. La amplificación de los genes N, RdRp/Hel y RdRp en las muestras de los pacientes, pero no en NTC, se muestra en la Figura 5A, B. Dado que el RT-LAMP es una estrategia atractiva para el diseño de POCT en el futuro, las amplificaciones de este protocolo se implementaron en un termociclador convencional y un baño de agua (Figura 6).
El segundo paso en la estandarización del protocolo fue definir la estrategia colorimétrica, por lo que el rojo fenol y el rojo neutro fueron los primeros colorantes evaluados; para su evaluación, se sondeó la concentración de diferentes colorantes (Figura 7), pero no se observó cambio de color después de la amplificación con ninguna de las concentraciones ensayadas. Este resultado podría explicarse por el hecho de que ambos colorantes son indicadores de pH, es decir, son sensibles al pH de la muestra, especialmente si el ARN viral fue eluido en Buffer TE, como fue el caso de las muestras de pacientes evaluadas con este protocolo. Se investigó el azul de hidroxinaftol (HNB) porque su color cambia con cambios en la concentración de Mg2+, que se reduciría durante la reacción de amplificación como cofactor de la enzima polimerasa. En este caso, se probaron diferentes concentraciones de HNB para determinar cuál permitía el mejor cambio de color después de la amplificación, lo que ocurre en la reacción con 125 μM de HNB (Figura 8). En la Tabla 5 se incluye una descripción completa de los reactivos empleados en la preparación de la mezcla de amplificación para los genes N y RdRp/Hel mediante LAMP colorimétrico.
Después de determinar las mejores condiciones para la detección colorimétrica, se amplificaron muestras de pacientes con diferentes números de genomas virales. En la figura 9 se muestra la amplificación de las muestras, en la que se produce un cambio de color en las muestras según la concentración del genoma viral. Los resultados de la amplificación también se visualizaron mediante electroforesis de agarosa, confirmando la amplificación de las muestras de los pacientes, pero no la NTC.
Figura 2: Diagrama del baño de agua utilizado para amplificar los genes del SARS-CoV-2 mediante la técnica LAMP. (A) Vista frontal y (B) vista superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Montaje de la cámara de electroforesis. (A) Diagrama de la cámara de electroforesis utilizada para separar los productos de PCR. (B) Formación de la cámara interna para la preparación del gel de agarosa. (C) Adición de la agarosa fundida en la cámara interna. (D) Desmontaje de la cámara interior para acomodar el gel en la posición de funcionamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Estandarización de las condiciones de amplificación de los cebadores y la enzima Bst 3.0. (A) Cada carril muestra una temperatura de gradiente diferente, que oscila entre 63 °C y 67 °C. De izquierda a derecha, marcador de peso molecular (MWM), sin control de plantilla (-), carril 1: 67 °C; carril 2: 66,8 °C; carril 3: 66,3 °C; carril 4: 65,5 °C; carril 5: 64,6 °C; carril 6: 63,9 °C; carril 7: 63,4 °C; carril 8: 63 °C. (B) B1: 8,0 U/μL de Bst 3,0; B2: 6,4 U/μL de Bst 3,0; B3: 4,8 U/μL de Bst 3,0; B4: 3,2 U/μL de Bst 3,0; 1: Sin control de plantilla; y 2: muestra de paciente EEDD8 (Ct = 23,39). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación de los genes N y RdRp/Hel presentes en el virus SARS-CoV-2 mediante la técnica LAMP. (A) Replicar 1 y (B) Replicar 2, donde MWM: marcador de peso molecular; 1: Sin control de plantilla; 2: muestra de paciente E1123 (Ct = 19,95); 3: muestra de paciente E1324 (Ct = 26,01); 4: muestra de paciente EEDD10 (Ct = 30,09); RH: gen RdRp/Hel y N: gen N. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación del gen RdRp presente en el virus SARS-CoV-2 mediante la técnica LAMP. La reacción se llevó a cabo en (A) un termociclador y (B) un sistema de baño de agua. MPM: marcador de peso molecular; 1: Sin control de plantilla; 2: muestra de paciente E1123 (Ct = 19,95); 3: muestra de paciente E1757 (Ct = 23,67); 4: muestra de paciente E1604 (Ct = 23,98); 5: muestra de paciente E1245 (Ct = 25,99); 6: muestra de paciente E1324 (Ct = 26,01); 7: muestra de paciente EEDD7 (Ct = 26,56); 8: muestra de paciente 24 (Ct = 37,99) y R: gen RdRp. *Se refiere a las amplificaciones que fueron sometidas a 60 min de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Amplificación del gen RdRp presente en el virus SARS-CoV-2 mediante la técnica LAMP con detección colorimétrica. Tubos (A) antes y (B) después de la reacción, donde 1: Sin control de plantilla; 2: muestra de paciente E1123 (Ct=19,95); 3: muestra de paciente E1757 (Ct=23,67); 4: muestra de paciente E1324 (Ct=26,01); PR: Rojo Fenol; y NR: Rojo Neutro. Para cada colorante, se evaluaron cuatro concentraciones en la reacción final (50 μM, 75 μM, 100 μM y 120 μM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Amplificación del gen RdRp presente en el virus SARS-CoV-2 mediante la técnica colorimétrica LAMP, utilizando el indicador azul de hidroxinaftol. Tubos (A) antes y (B) después de la reacción, donde 1: Sin control de plantilla; 2: muestra de paciente E1594 (Ct=20,75); 3: muestra de paciente E990 (Ct=22,67); 4: muestra de paciente E1245 (Ct=25,99). Para este colorante, se evaluaron cuatro concentraciones en la reacción final (50 μM, 75 μM, 100 μM y 125 μM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Amplificación de las muestras. Tubos (A) antes y (B) después de la reacción por LAMP utilizando el indicador azul de hidroxinaftol. (C) Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación del gen N presente en el virus SARS-CoV-2 mediante la técnica colorimétrica LAMP. MPM: marcador de peso molecular; NTC: sin control de plantilla; S1: muestra de paciente E1594 (Ct = 20,75); S2: muestra de paciente E990 (Ct = 22,67); S3: muestra de paciente E1245 (Ct = 25,99). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gen diana | Cebador | Secuencia de cebadores (5' → 3') | |||
| N (Zhang et al., 2020) |
N-F3 | TGGCTACTACCGAAGAGCT | |||
| N-B3 | TGCAGCATTGTTAGCAGGAT | ||||
| N-FIP | TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGG | ||||
| N-BIP | AGACGGCATCATGTGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT | ||||
| N-LF | GGACTGAGATCTTTCATTTTACCGT | ||||
| N-LB | ACTGAGGGAGCCTTGAATACA | ||||
| RdRp | R-F3 | CTATGGTGGTTGGCACAA | |||
| R-B3 | TTGAGCACACTCATTAGCT | ||||
| R-FIP | GCATGGCTCTATCACATTTAGGATA-GTTTATAGTGATGATAGAAAACCCTC | ||||
| R-BIP | ACATGCTTAGAATTATGGCCTCAC-TCTATAGAAACGGTGTGACAAG | ||||
| R-LB | TGTTCTTGCTCGCAAACATACAACG | ||||
| RdRp/Hel | RH-F3 | GGTATTGGGAACCTGAGTT | |||
| RH-B3 | GACAAGACTAATTTATGTGATGTTG | ||||
| RH-FIP | GCAAAGAACACAAGCCCCCCAACTTATGAGGCTATGTACACACC | ||||
| RH-BIP | TTCACAGACTTCATTAAGATGTGGTACATGGTCGTAACAGCAT | ||||
| RH-LB | GCTTGCATACGTAGACCATTCTT | ||||
Tabla 1: Secuencias de cebadores para la detección de SARS-CoV-2 por RT-LAMP.
| Componente | Culata (μM) | Mezcla de imprimación 10x (μM) | Volumen (μL) |
| Imprimación exterior delantera (F3) | 100 | 2 | 12.5 |
| Imprimación exterior hacia atrás (B3) | 100 | 2 | 12.5 |
| Imprimación interior delantera (FIP) | 100 | 8 | 50 |
| Imprimación interior hacia atrás (BIP) | 100 | 8 | 50 |
| Bucle de avance (LF) | 100 | 4 | 25 |
| Bucle hacia atrás (LB) | 100 | 4 | 25 |
| Agua sin nucleasas* | --- | --- | 450 |
| Volumen total | 625 | ||
Tabla 2: Preparación de 10x mezcla de imprimación RT-LAMP. La mezcla de cebadores genéticos RdRp no contiene el cebador LF; por lo tanto, reemplace este volumen con agua libre de nucleasas. *En lugar de agua libre de nucleasas, se pueden utilizar 10 mM de Tris pH 8.0 preparado en DEPC 0.1% de agua.
| Artículo | Reactivos | Concentración final para 25 μL | 1 muestra (μL) |
| 1 | Búfer 10x | 1 vez | 2.5 |
| 2 | 100 mM MgSO4 | 4 mM + 2 mM en búfer = 6 mM | 1.0 |
| 3 | DNTP de 10 mM | 1,4 mM | 3.5 |
| 4 | 10x Imprimadores de mezcla | 1x [ 0,2 μM F3/B3; 0,8 μM FIP/BIP; 0,4 μM LB] | 2.5 |
| 5 | Bst 3.0 DNA pol (8000 UI/mL) | 3.2 UI | 0.4 |
| 6 | RTx (15000 UI/mL) | 1.5 UI | 0.1 |
| 7 | Q5 ADN pol (2000 UI/mL) | 0,15 UI | 0.1 |
| 8 | Agua libre de nucleasas | N/A | 11.9 |
| 9 | Muestra de ARN | N/A | 3.0 |
| 10 | Volumen total de reacción | 25 | |
Tabla 3: Preparación de la mezcla de amplificación del gen RdRp por LAMP.
| Artículo | Reactivos | Concentración final para 25 μL | 1 muestra (μL) |
| 1 | Búfer 10x | 1 vez | 2.5 |
| 2 | 100 mM MgSO4 | 6 mM + 2 mM en tampón = 8 mM | 1.5 |
| 3 | DNTP de 10 mM | 1,4 mM | 3.5 |
| 4 | 10x Imprimadores de mezcla | 1x [ 0,2 μM F3/B3; 0,8 μM FIP/BIP; 0,4 μM LF/LB] | 2.5 |
| 5 | Bst 3.0 DNA pol (8000 UI/mL) | 3.2 UI | 0.4 |
| 6 | RTx (15000 UI/mL) | 1.5 UI | 0.1 |
| 7 | Q5 ADN pol (2000 UI/mL) | 0,15 UI | 0.1 |
| 8 | Agua libre de nucleasas | N/A | 11.4 |
| 9 | Muestra de ARN | N/A | 3.0 |
| 10 | Volumen total de reacción | 25 | |
Tabla 4: Preparación de la mezcla de amplificación de los genes N-A y RdRp/Hel mediante LAMP.
| Artículo | Reactivos | Concentración final para 25 μL | 1 muestra (μL) |
| 1 | Búfer 10x | 1 vez | 2.5 |
| 2 | 100 mM MgSO4 | 6,5 mM + 2 mM en tampón = 8,5 mM | 1.6 |
| 3 | DNTP de 10 mM | 1,4 mM | 3.5 |
| 4 | 10x Imprimadores de mezcla | 1x [ 0,2 μM F3/B3; 0,8 μM FIP/BIP; 0,4 μM LF/LB] | 2.5 |
| 5 | 1 mM Azul de hidroxinaftol | 125 μM | 3.1 |
| 6 | Bst 3.0 DNA pol (8000 UI/mL) | 3.2 UI | 0.4 |
| 7 | RTx (15000 UI/mL) | 1.5 UI | 0.1 |
| 8 | Q5 ADN pol (2000 UI/mL) | 0,15 UI | 0.1 |
| 9 | Agua libre de nucleasas | N/A | 8.2 |
| 10 | Muestra de ARN | N/A | 3.0 |
| 11 | Volumen total de reacción | 25 | |
Tabla 5: Preparación de la mezcla de amplificación de los genes N-A y RdRp/Hel por LAMP colorimétrico.
| Temperatura | Hora |
| 66,3 °C | 60 minutos |
| 80 °C | 5 minutos |
| 4 °C | ∞ |
Tabla 6: Condiciones térmicas utilizadas para la amplificación de los genes RdRp, N-A y RdRp/Hel por LAMP.
| Teñir | Depende del pH | Color antes de la reacción | Color después de la reacción | Comentarios | ||
| Azul de hidroxinaftol | No | Violeta | Celeste | Con este colorante la concentración de magnesio es crítica y debe estar entre 8 mM y 8,5 mM en la reacción final. De esta manera, se garantiza la transición de color del violeta al azul cielo. | ||
| Rojo Cresol | Sí | Fuscia | Amarillo | La presencia de tampones en los eluidos de ARN o en los reactivos puede impedir la reducción del pH y afectar el cambio de color cuando finaliza la reacción. Por lo tanto, en el caso del ARN y los cebadores, se recomienda no utilizar tampón TE para la elución y la resuspensión/dilución, respectivamente. | ||
| Rojo neutro | Sí | Amarillo tenue o naranja tenue | Fuscia | |||
| Rojo de fenol | Sí | Fuscia | Amarillo | |||
Tabla 7: Comparación de los colorantes utilizados en la detección visual de LAMP colorimétrica.
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Discussion
Aunque el RT-LAMP se considera una metodología complementaria para realizar diagnósticos moleculares, también tiene algunas limitaciones y pasos críticos que deben tenerse en cuenta cuando se estandariza e implementa el protocolo.
La estandarización de LAMP para la detección de SARS-CoV-2 evaluó los siguientes parámetros y componentes en la mezcla maestra: (a) concentración y temperatura de alineación de los cebadores; b) concentración de las enzimas; c) concentración de magnesio; d) tiempo de reacción; (e) inclusión de aditivos como BSA, DMSO, cloruro de guanidinio; f) diseño de los cebadores; (g) adición de colorante; h) Utilización de tampones de reacción y enzimas recombinantes de producción propia.
Este proceso de estandarización comenzó con seis juegos de cebadores, dos reportados por Zhang et al.14 y cuatro diseñados por la empresa BioDx. Este último fue diseñado desde cero con herramientas disponibles en línea y fue seleccionado por su alta especificidad contra el SARS-CoV-2, según lo determinado por BLAST. Además, su evaluación termodinámica mostró una menor tendencia a formar dímeros de cebadores o estructuras de horquilla que favorecían la autoamplificación.
Debido al impacto que tienen los cebadores en la estandarización de la técnica y a los resultados de experimentos previos en los que se encontró amplificación en NTCs, se realizó un nuevo diseño de cebadores para los genes N, S, RdRp y RdRp/Hel. Estos fueron sometidos a varios análisis bioinformáticos para garantizar su especificidad y la reducción de la tendencia a formar estructuras autoamplificadoras. Los cebadores seleccionados cumplieron con los parámetros bioinformáticos establecidos (ΔG > -5.0 y especificidad demostrada por BLAST).
Los ensayos in silico tienen un papel muy importante en la predicción del comportamiento que se puede observar en las reacciones in vitro, ya que pueden utilizarse como filtro inicial para la selección de cebadores. Sin embargo, estas predicciones no son iguales en todos los casos; Por lo tanto, no se pueden utilizar como un parámetro de selección definitivo, sino más bien como una primera aproximación. El comportamiento real de los cebadores en la técnica se determina directamente durante la reacción y la evaluación visual por colorimetría o en un gel de agarosa. Por último, los resultados dudosos o poco claros suelen ser repetidos por otro analista o descartados; ya que no se puede informar un resultado no concluyente en el contexto del diagnóstico.
Uno de los pasos críticos más importantes es la alta probabilidad de contaminación cuando se está desarrollando el protocolo, lo que se refleja en la amplificación del NTC. Esto podría evitarse siguiendo las buenas prácticas de laboratorio como procedimientos adecuados de desinfección y limpieza antes de manipular reactivos y muestras, usar siempre el EPP requerido, manejar los implementos con cuidado dentro de la cabina de flujo laminar y desarrollar cada paso del proceso en espacios separados de uso exclusivo, como un espacio para mezclar reactivos, otro para agregar la muestra a evaluar y otro para realizar el proceso de amplificación.
La amplificación de NTC podría ser causada por contaminación, pero también por dimerización del cebador. Por esta razón, otro paso crítico es el diseño de la imprimación y la identificación de las condiciones óptimas para evitar la dimerización de la imprimación. Es fundamental en el proceso de diseño de cebadores encontrar el conjunto de cebadores con parámetros termodinámicos que reduzcan la probabilidad de formación de estructuras secundarias, lo que se mide con energía libre, por lo que se requiere una evaluación termodinámica del conjunto de cebadores elegido. En este protocolo se empleó la herramienta PrimerDimer12 para la evaluación termodinámica; con la opción de examen Multiplex, cada cebador se compara con todos los demás cebadores dentro del grupo para detectar posibles formaciones de dímeros, y la opción de informe de marco de dímeros informa la estructura del dímero más estable de cada par de cebadores. Esta información es muy útil para seleccionar un buen juego de imprimaciones.
Además, la identificación de la concentración adecuada de reactivos, como MgSO4, dNTP, cebadores, enzima Bst 3.0 y parámetros de amplificación, como Tm y tiempo de incubación, es fundamental para evitar la dimerización del cebador durante el proceso de amplificación. Además, es posible añadir compuestos que reducen la formación de dímeros de cebadores durante la amplificación, por ejemplo, albúmina sérica bovina, dimetilsulfóxido (DMSO)16 y cloruro de guanidinio17.
Otro aspecto crítico del proceso de diseño de imprimaciones es determinar la especificidad de cada imprimación. Para este protocolo, esta evaluación se realizó con BLAST. Sin embargo, también es importante evaluar la especificidad del proceso de amplificación de los cebadores utilizando otro virus que esté filogenéticamente relacionado pero no relacionado con el SARS-CoV-2.
Por otro lado, la sensibilidad y el límite de detección (número mínimo de genomas detectables) no se determinaron durante la estandarización de la técnica. En primer lugar, las muestras entregadas por el Hospital Universitario Fundación Valle del Lili no fueron cuantificadas para determinar el número de copias virales debido a restricciones internas derivadas de la contingencia sanitaria que se encontraba en ese momento en Colombia (2020). La estimación de la concentración de material genético se aproximó con el Cq de la RT-qPCR, ya que a menor Cq, mayor número de copias virales, mientras que a mayor Cq, menor número de copias virales. El Cq más bajo probado fue de 14,81 y el más alto fue de 38,93, donde no aparecen productos de amplificación. Adicionalmente, en 2020 la prueba RT-qPCR aprobada para su uso en Colombia fue cualitativa y no cuantitativa, es decir, solo determinó presencia o ausencia según Cq. Un resultado con Cq ≥ 40 fue negativo, pero un Cq < 40 fue positivo. Los protocolos utilizados en Colombia para la detección de COVID-19 fueron el protocolo de Berlín1, el Panel de diagnóstico RT-PCR en tiempo real CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV)2, y particularmente en el Hospital Universitario Fundación Valle del Lili, se utilizó el ensayo Allplex 2019-nCoV3. Lamentablemente no contamos con más muestras aprobadas por el comité de ética suministrado por el Hospital Universitario Fundación Valle del Lili para continuar con estos experimentos.
Además, la disponibilidad de reactivos es una barrera importante para el diagnóstico oportuno de nuevos casos en una emergencia de salud pública mundial, la causada por el SARS-CoV-2. Como resultado, este protocolo se creó para evitar el uso de kits y reactivos comerciales importados y costosos, y la preparación de los tampones de amplificación se detalla en este protocolo. Además, se evaluaron algunos colorantes que podrían ser utilizados en ensayos de colorimetría, así como algunas consideraciones para su uso (Tabla 7).
Este método diagnóstico tiene algunas limitaciones porque no permite la cuantificación del genoma viral en la muestra. Además, la detección del color es una medida subjetiva porque depende de la capacidad visual de la persona que realiza el protocolo. Sin embargo, debido a que no requiere de equipos especializados ni de personal capacitado en biología molecular, este protocolo es adaptable a la detección de diferentes patógenos y podría implementarse fácilmente una vez que se haya estandarizado. Así, su aplicación podría extenderse a otras muestras, como ambiental 18,19,20 y centros de salud, para realizar una vigilancia epidemiológica oportuna.
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Disclosures
Natalia Campillo-Pedroza es CEO de la empresa BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S. El resto de los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Sistema General de Regalías de Colombia, beca número BPIN 2020000100092, y Universidad Icesi - Convocatoria Interna, beca número CA0413119. El MFVT también fue financiado por los Fondos de Cátedra Asistente de la Universidad de los Andes. Las entidades financiadoras no participaron en el diseño, la ejecución de las actividades, la recopilación de datos, el análisis de datos y la preparación del manuscrito. Agradecemos al Hospital Universitario Fundación Valle del Lili por el ARN viral de las muestras de Sars-CoV-2 y al Dr. Álvaro Barrera-Ocampo por los comentarios al manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb DNA Ladder | SOLIS BIODYNE | 07-12-00050 | Store at -20 °C |
| 50x TAE Electrophoresis Buffer | ThermoScientific | B49 | Store at roome temperature |
| Accuris High Fidelity Polymerase | ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS | PR1000-HF-200 | It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| Agarose | PanReacAppliChem | A8963,0100 | N/A |
| Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL | New England BioLabs | M0374S/M0374L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | Store at -20 °C |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220-25G | Handle it with caution under an extraction cabinet |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use | ThermoScientific | SM0322 | Store at -20 °C |
| Hydroxy naphthol blue disodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-215156B | N/A |
| Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL | New England BioLabs | M0491S/M0491L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL | New England BioLabs | M0380S/M0380L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
References
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- Biolabs, N.E. Neb Lamp, NEB LAMP. , https://lamp.neb.com/ (2023).
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- Haque, M. F. U., et al. A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan. Virus Research. 302, 198484 (2021).
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