Summary
Burada, ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) ile insan örneklerinde SARS-CoV-2 virüsünü tespit etme yöntemini standartlaştırmak ve uygulamak için eksiksiz bir protokol sunuyoruz. 60 dakika içinde yapılan bu yöntem, düşük maliyetle ve ucuz ekipman kullanılarak herhangi bir laboratuvara veya bakım noktasına uyarlanabilir.
Abstract
Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) virüsü insan sağlığını önemli ölçüde etkiledi. Modern toplum için bir tehdit olmaya devam ediyor çünkü birçok insan enfeksiyon sonucu ölüyor. Hastalık, altın standart gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gibi serolojik ve moleküler testler kullanılarak teşhis edilir. Sonuncusunun çeşitli dezavantajları vardır çünkü özel altyapı, maliyetli ekipman ve eğitimli personel gerektirir. Burada, insan örneklerinde ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) kullanarak SARS-CoV-2 virüsünü tespit etmek için gerekli adımları özetleyen bir protokol sunuyoruz. Protokol, in silico primerlerin tasarlanması, reaktiflerin hazırlanması, amplifikasyon ve görselleştirme için talimatlar içerir. Standartlaştırıldıktan sonra, bu yöntem 60 dakika içinde düşük maliyetle ve ucuz ekipman kullanılarak herhangi bir laboratuvara veya bakım noktasına kolayca uygulanabilir ve uyarlanabilir. Farklı patojenleri tespit etmek için uyarlanabilir. Bu nedenle, zamanında epidemiyolojik sürveyans yapmak için sahada ve sağlık merkezlerinde potansiyel olarak kullanılabilir.
Introduction
Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2), 2019 koronavirüs hastalığına (COVID-19) neden olur. Dünya Sağlık Örgütü, 30 Ocak 2020'de uluslararası endişe verici bir halk sağlığı acil durumu ve 11 Mart 2020'de bir pandemi ilan etti. Pandemi, bu makalenin yazıldığı tarih itibariyle 760 milyondan fazla vaka ve 6,87 milyon ölümle sonuçlandı1.
Bu virüsün etkisi, bulaşıcı hastalık tespiti ve kontrolünü iyileştirmek için daha iyi, daha doğru, daha hızlı ve daha yaygın olarak kullanılabilen gözetim araçlarına olan ihtiyacı vurgulamıştır 2,3. Pandemi sırasında, SARS-CoV-2 tanı testleri nükleik asit, antikorlar ve proteinlerin tespit edilmesine dayanıyordu, ancak nükleik asidin RT-PCR tespiti altın standarttır4. Bununla birlikte, RT-PCR'nin bazı sınırlamaları vardır; Moleküler biyoloji konusunda eğitim almış özel ekipman, altyapı ve personel gerektirir ve uygulamasını özel laboratuvarlarla sınırlar. Ayrıca, numunelerin laboratuvara taşınması için gereken süre dahil olmak üzere zaman alıcıdır (4-6 saat),bu da 5 gün sürebilir. Bu kısıtlamalar, verimli numune işlemeyi ve acil durum planlaması ve epidemiyolojik yönetim için gerekli bilgilerin elde edilmesini engeller.
Ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyonun (RT-LAMP), RT-PCR'ye göre çeşitli avantajları vardır, bu da onu, özellikle kaynak kısıtlı ortamlarda gelecekteki bakım noktası tanı testlerini (POCT) tasarlamak için çekici bir strateji haline getirir6. Birincisi, büyük ölçüde spesifiktir, çünkü DNA veya RNA7,8 olsun, hedef dizideki altı ila sekiz alanı tanıyan dört ila altı primer kullanır. İkincisi, sabit bir sıcaklıkta çalıştığı için, amplifikasyonu oluşturmak için gerçek zamanlı termal döngüleyiciler gibi karmaşık ekipmanlara ihtiyaç duymaz ve onu çalıştırmak için yüksek eğitimli personel gerektirmez. Üçüncüsü, reaksiyon süresi çok kısadır (~ 60 dakika) ve çok özel olmayan reaktifler kullanılır, bu da onu uygun maliyetli bir araç haline getirir6. Yukarıda belirtilenler ve COVID-19 pandemisinin neden olduğu sağlık acil durumu göz önüne alındığında, bu teknik, herhangi bir araştırma laboratuvarında hızlı, ucuz ve uygulanması kolay alternatif bir tanı yöntemi olarak görülebilir9.
SARS-CoV-2'yi bir termodöngüleyici ve bir su banyosu kullanarak kolorimetrik yöntemlerle tespit etmek için bir RT-LAMP'nin standartlaştırılması ve uygulanmasına ilişkin protokol bu makalede açıklanmaktadır (Şekil 1). Kritik noktalar, sınırlamaları ve bunları ilerletmek için alternatifler tartışılmaktadır.
Şekil 1: RT-LAMP tekniği kullanılarak SARS-CoV-2'yi yükseltmek için protokolün şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kullanılan örnekler, Fundación Valle del Lili Üniversite hastanesinin klinik laboratuvarı tarafından sağlandı ve RT-qPCR tekniği kullanılarak COVID-19 testi pozitif çıkan hastalardan alınan saflaştırılmış RNA'ya karşılık geldi. Tüm hastalar araştırma için bilgilendirilmiş onam verdi ve bu çalışma Fundación Valle del Lili Üniversitesi hastanesinden insan çalışmaları için biyoetik komitesi tarafından onaylandı.
1. RT-LAMP astar tasarımı ve hazırlanması
NOT: LAMP astarları, New England BioLabs (NEB) LAMP, Primer Explorer ve LAMP tahlil çok yönlü analizi (LAVA) dahil olmak üzere çeşitli platformlarla kullanılabilir. Ancak bu protokol için NEB LAMP aracı kullanıldı. Primer tasarımı, NextStrain veri tabanı10'dan elde edilen SARS-CoV-2 genomları kullanılarak yapılabilir. Tablo 1 , bu protokolde kullanılan astar setini göstermektedir.
- LAMP için astar tasarımı
- Viral genom dizileri elde edin.
- Konsensüs sırasını elde etmek için dizi hizalamaları gerçekleştirin.
- NEB LAMP astar tasarım aracı platformu11'e gidin ve hızlı kılavuzdaki talimatları izleyin. Bu araç, primer explorer V5 ile aynı sonuçları verir, ancak çıktısında çok daha kullanıcı dostudur. Astar tasarımı için kılavuz olarak astar gezgini kullanım kılavuzlarını kullanın.
- Primer setinin termodinamik değerlendirmesi
- Elde edilen astarlar üzerinde termodinamik bir analiz yapmak için Primer-Dimer12 aracını kullanın.
- Astar dizilerini alete yerleştirin. Ardından, Multipleks Analizi ve Dimer Yapı Raporu seçeneğini seçin.
- ΔG'si -5'ten az olmayan astar setlerini seçin.
- Tasarlanan primerlerin özgüllük değerlendirmesi
- Her bir astarı analiz etmek için BLAST13'teki Nükleotid koleksiyonu (nt/nt) veritabanını kullanın.
- İlk BLAST analizini gerçekleştirmek için, Refseq_rna Veri Tabanını seçin ve aramayı Orthocoronavirinae alt familyasına ait cins grubuyla filtreleyin. Bunlar Alfakoronavirüs (taksi:693996), Gamakoronavirüs (taksi:694013) ve Deltakoronavirüs (taksi:1159901). Ek olarak, diziyi H1N1 alt tipi (taksi:114727), İnfluenza A virüsü (taksi:11320) ve İnfluenza B virüsü (taksi:11520) olarak birlikte dolaşan diğer virüslere karşı değerlendirin.
- İkinci BLAST analizini gerçekleştirmek için Betacoronavirus GenBank'ı seçin ve aramayı Coronaviridae (taxid:11118) ve SARS (taxid:694009) ile filtreleyin. Bu gruplar, yarasalarda bulunan genomlar, Betacoronavirus (taksi:694002) dahil olmak üzere tanımlanmış tüm SARS Coronavirus genomlarının dizilerini içerir.
- Bu protokol için, primerlerin hedef genom olan SARS-CoV-2 dışındaki genomlarla hizalanmadığından emin olun.
- Astar hazırlama
- Tüp açma sırasında kayıpları önlemek için iyofilize primerleri içeren şişeleri bir mikrosantrifüj (10.000 x g, oda sıcaklığında [RT]) ile döndürün.
- İyofilize tozu %0.1 dietil pirokarbonat (DEPC) su veya nükleaz içermeyen su içinde 100 μM'lik nihai konsantrasyona kadar yeniden sulandırın (Tablo 2) ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice çözün. Daha sonra, tüpün altındaki tüm primer çözeltilerini toplamak için bir mikrosantrifüjde maksimum hızda (10.000 x g, RT'de 1 dakika) döndürün.
- 10x astar karışımını, Tablo 2'de belirtildiği gibi ileri iç astar (FIP), geri iç astar (BIP), ileri dış astar (F3), geri dış astar (B3), geriye doğru döngü (LB) ve döngü ileri (LF) astarları ile bir biyogüvenlik kabini altında hazırlayın. Kayıpları önlemek için, bir mikrosantrifüj ile hızlı bir sıkma (10.000 x g, RT'de 1 dakika) gerçekleştirmeden önce astar çözeltisini pipetleyin veya hafifçe girdaplayın.
- Uzun süreli saklama için 10x astar karışımını -20 °C'de saklayın; Bununla birlikte, çok fazla donma-çözülme döngüsünden kaçınmak için birkaç numuneden bağımsız olarak en fazla beş deney için yeterince hazırlık yapın.
NOT Daha küçük bir hacimde astar karışımına ihtiyaç duyulursa, yeni hacimleri hesaplayarak değerleri ayarlayın (Tablo 2). Ayrıca, RdRp ve RdRp/Hel setleri LF primerini içermez çünkü RT-LAMP reaksiyonları için döngü primerleri gerekli değildir. Sonuç olarak, LF astarının hacmini nükleaz içermeyen su veya %0,1 DEPC su ile değiştirin.
2. RT-LAMP reaksiyonu
- Laminer akış kabinini üreticinin talimatlarına göre açın ve hava akışının stabilize olması için en az 3 dakika bekleyin.
- Hava akışı stabil hale geldiğinde, kabinin iç yüzeylerini aseptik bir teknik kullanarak temizleyin ve sterilize edin. Bunu başarmak için aşağıdaki dezenfektanları şu sırayla kullanın: 1000 ppm kuaterner amonyum (benzalkonyum klorür), %2 hipoklorit, %3 hidrojen peroksit ve %70 etanol.
NOT: Bu durumda, aseptik teknik, dezenfektanın uygulanmasını ve daha önce temizlenmiş yüzeylerin üzerinden geçmeden kabinin içinden dışarıya peçetelerle çıkarılmasını gerektirir. - Adım 2.2'deki dezenfektanları kullanarak kabine girecek malzemeleri aynı sırayla temizleyin.
NOT: Mikropipetler, filtre ucu kutuları, 1.5 mL ve 0.6 mL tüplü şişeler, 0.2 mL PCR tüpleri, raflar ve 400 mL beher kabine getirilmelidir. - Kabine biraz peçete ve nitril eldiven getirin. Bundan sonra kabini kapatın ve 15 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakın.
DİKKAT: Uzun süreli radyasyona maruz kalmaktan kaynaklanan doku ve DNA hasarını önlemek için, adım 2.4'te belirlenen süre sona erene kadar UV ışığından kaçının.
NOT Protokole başlamadan önce Şekil 2'de gösterilen montajı gerçekleştirin ve adım 2.4'ü tamamladıktan sonra su banyosuna başlayın. Metal kabı neredeyse ağzına kadar içme suyu ile doldurmak ve demir laboratuvar ısıtma plakasının sıcaklığını 90 °C'ye ayarlamak çok önemlidir, çünkü bu, cıvalı termometre ile izlenen sistemde ~66.3 °C'lik bir sıcaklığa neden olacaktır. - Işınlama süresi sona erdikten sonra kabini yeniden başlatın ve adım 1.1'deki önerileri izleyin.
- Reaktifleri (Tablo 3, Tablo 4 ve Tablo 5) buz dolu bir soğutucuya veya küçük polistiren buzdolabına yerleştirin. Kabı %70 etanol ile temizledikten sonra kabine koyun.
- 0.6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, amplifiye edilecek genin LAMP karışımını (RdRp, NA ve RdRp / Hel) hazırlayın ve yalnızca aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 10x Tampon, MgSO4, dNTP'ler, 1x primer karışımı ve nükleaz içermeyen su veya% 0.1 DEPC suyu; Homojen hale getirmek için pipetleyerek iyice karıştırın.
DİKKAT: Kabin içindeki yanlış kullanım ve davranış nedeniyle, reaktif kontaminasyonu riski yüksektir. Bu sorunu azaltmak için aşağıdaki kurallara uyulmalıdır: (i) steril ve filtre uçları kullanın; (ii) her reaktif için bir uç kullanın; (iii) laminer akışı bozmamak için yavaş ve dikkatli hareket edin; (iv) düzeni korumak ve en az malzemeyi kullanmak; ve (v) karışımı hazırlamak ve genetik materyali eklemek için farklı eldivenler kullanın.
NOT: Tüm reaktifleri, özellikle enzimleri, buz üzerinde tutun, çünkü sıcaklık değişiklikleri onları denatüre edebilir ve polimeraz aktivitesini değiştirebilir. - 0.6 mL'lik tüp(ler)i kapağı kapalı olarak bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve 95 °C'de 5 dakika inkübe edin.
NOT: LAMP karışım hazırlığına başlamadan önce kabinin dışında bulunan 1.5-2.0 mL tüpler için ısıtma bloğunu en az 30 dakika açın ve sıcaklığı (95 °C) bir cıva veya alkol termometresi ile izleyin. - Kuluçka tamamlandığında, tüpleri 5 dakika boyunca buz dolu bir polistiren soğutucuya yerleştirin.
- Tüpleri laminer akış kabinine geri koyun ve DNA polimeraz (Bst 3.0), ters transkriptaz ve yüksek kaliteli DNA polimeraz (Tablo 3, Tablo 4 ve Tablo 5) enzimlerini ekleyerek LAMP karışım hazırlığını tamamlayın. Kolorimetrik algılama kullanılması durumunda, hidroksinaftol mavisi (HNB) boyasını ekleyin.
- Bu reaktifleri ekledikten sonra, enzimleri ve boyayı çözündürmek için LAMP reaktiflerini pipetleyerek çok iyi karıştırın.
- Her bir PCR tüpünü 22.0 μL karışımla doldurun ve kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. Ardından, negatif kontrol veya tüpsüz şablon kontrolüne (NTC) 3.0 μL %0.1 DEPC su veya nükleaz içermeyen su ekleyin ve kalan tüp(ler)i ekleme (genetik materyal) için bir kenara koyun.
NOT : Bst 3.0 enzimini aktive etmekten ve reaksiyonu erken başlatmaktan kaçınmak için numune eklenene kadar PCR tüplerini buz dolu bir soğutucuda tutun. - Tüm malzemeleri kabinden çıkarın ve yüzeyleri temizlemek için %70 etanol kullanın. Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek kapatın.
- Ayrı bir alanda, her bir PCR tüpüne 3 μL numune ekleyin ve iyice homojenize edin. Bunu gerçekleştirmek için 20 μL'lik bir mikropipet ve filtre uçları kullanın.
DİKKAT: Genetik materyali eklemek için kullanılan mikropipet yalnızca bu amaç için kullanılmalıdır ve karışımı hazırlamak için kullanılamaz. Bu şekilde, reaktiflerin kontaminasyonu önlenir. Ek olarak, RNA bozunması olasılığını azaltmak için RNA örneklerini her zaman buzun üzerinde tutun. Numune eklemek için aşağıdaki kişisel koruyucu ekipmanı (KKD) kullanın: tek kullanımlık önlük, şapka, N95 maskesi, tozluk, laboratuvar gözlüğü ve nitril eldivenler. - Kolorimetrik reaksiyonu gerçekleştirmeden önce, yüksek kaliteli bir kamera ile PCR tüplerinin fotoğraflarını çekin. HNB ile başlangıç rengi menekşe rengidir.
- Reaksiyonu aşağıdaki sistem veya ekipmanda gerçekleştirin: (i) termal döngüleyici ve (ii) su banyosu.
- Termal döngüleyici: Tüpleri reaksiyon bloğuna yerleştirin ve termoprofili (bkz. Tablo 6) ekipman üzerine kurun.
- Su Banyosu: Tüpleri dairesel kaplara koyun ve dışarı çıkmalarını önlemek için çok iyi ayarlayın. Bundan sonra, kapları Tablo 2'da listelenen sıcaklıkta su banyosuna (Şekil 6A, B) yerleştirin.
- Su banyosu durumunda, tüpler sistemin içine girdikten sonra zamanlayıcıyı 60 dakika boyunca başlatın (Tablo 6).
- Reaksiyon süresinden sonra tüpleri termal döngüleyiciden veya su banyosundan çıkarın ve elektroforetik çalışma için 4 °C'de veya kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
- Kolorimetrik bir reaksiyon gerçekleştirildiyse, yüksek kaliteli bir kamera kullanarak PCR tüplerinin fotoğraflarını çekin. HNB ile son renk gök mavisidir.
3. Agaroz jel içindeki amplifikasyon ürünlerinin analizi
NOT: Bu adımlar, standardizasyon adımı sırasında kolorimetrik reaksiyon veya performans kontrolü için ek kontroller olarak önerilir. Bunun nedeni, tekniğin bu testleri yapan laboratuvar için büyük bir kontaminasyon riski oluşturabilmesidir.
- Yatağı, kenar lastikleri duvarlara temas edecek şekilde elektroforez odasının içine yerleştirin ve agaroz (iç oda) ilavesi için sızdırmaz bir alan yaratın (Şekil 3A, B).
- Adım 3.1'i tamamladıktan sonra,% 2'lik bir jel elde etmek için gerekli miktarda agarozu 500 mL'lik bir beherde tartın. Bundan sonra, gerekli hacimde 0.5x Tris-asetat EDTA (TAE) tamponu ekleyin ve 1-2 dakika mikrodalgada pişirin.
NOT: Agaroz, fırından çıkarıldığında yarı saydam ve topaksız olduğunda tamamen erir. Bu doğrulanmazsa, zayıf jelleşmiş bölgeler kalabilir ve bu da amplifikasyon ürünlerinin elektroforetik çalışmasının ve görselleştirmesinin değişmesine neden olabilir. - Beheri fırından çıkarın ve agarozu adım 3.1'de oluşturulan iç hazneye dökün (Şekil 3C). Ardından, kabarcık olmadığını kontrol edin ve varsa, bir mikropipet ucu kullanarak bunları çıkarın.
- Tarağı kuyucukları oluşturacak şekilde düzenleyin ve agarozu oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 30 dakika jelleşmeye bırakın.
- Bu süreden sonra, tarakların ve jeli içeren yatağın çıkarılmasını kolaylaştırmak için 5 mL 0.5x TAE tamponu ekleyin. Ardından jeli, oyuklar anotun içinde olacak şekilde konumlandırın (Şekil 3D).
- Elektroforez odasını üretici tarafından belirtilen kapasiteye kadar 0,5x TAE tamponu ile doldurun ve elektrotların tamponla temas halinde olduğundan emin olun.
- Jelin ilk oyuğuna 3 μL moleküler ağırlık markörü ekleyin ve sonraki oyuklara 9 μL NTC ve her bir numune ekleyin. Bunları, 7 μL amplifikasyon ürününü 3 μL yükleme tamponu ile birleştirerek yapın; daha sonra bu karışımın 9 μL'sini jelin kuyularına yükleyin.
- Elektroforez odasını kapakla kapatın ve kabloları renk desenindeki güç kaynağı bağlantı noktalarına bağlayın. Güç kaynağını aşağıdaki parametrelere ayarlayın: 100 V ve 120 dakika boyunca sabit amper.
- Elektroforetik çalışma tamamlandıktan sonra, jeli boyama solüsyonu (etidyum bromür) ile kabın içine koyun ve 30 dakika inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, jeli boyama solüsyonundan çıkarın ve kilitli bir torbaya koyun. Bu, amplikonları görselleştirmek için kullanılacak ekipmanın kirlenmesini önler.
- Jeli Amersham Imager 600 gibi bir aydınlatıcı veya görüntüleyici üzerinde görselleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolün uygulanması, yukarıda açıklanan protokolü izleyerek her bir hedef gen için primer setinin tasarlanmasıyla başlar. Haziran 2020'de, NextStrain veritabanından 5.000 SARS-CoV-2 genomu elde edildi ve Kolombiya genomlarının %10'luk bir temsiliyeti oldu. Bu diziler, astar tasarım sürecinde kullanılan konsensüs dizisini elde etmek için hizalandı. Tablo 1 , RdRp/Hel ve RdRp primerleri için seçilen primer setini göstermektedir. Gen N amplifikasyonu için primer seti, daha önce yayınlanmış bir rapordanelde edilmiştir 14.
Protokolün standardizasyonundaki ilk adım, NTC amplifikasyonunu önlemekti. Bu konuda doğrulanması gereken en önemli parametrelerden biri, astar seti için optimum erime sıcaklığının (Tm) ve Bst 3.0 konsantrasyonunun belirlenmesidir. Amplifikasyon için en iyi Tm'yi belirlemek için bir sıcaklık gradyanı kullanıldı (Şekil 4A). Bu protokolde kullanılan primer seti için optimal Tm 66.3 °C idi (Şekil 4A). Ayrıca, Bst 3.0 enziminin farklı konsantrasyonları değerlendirildi ve bu reaksiyon için en uygun konsantrasyon 3.2 lU/μL'dir (Şekil 4B). Kalan reaktifler için Lu ve ark.15 tarafından sağlanan konsantrasyonlar kullanıldı (Tablo 3, Tablo 4 ve Tablo 5).
Tm ve Bst 3.0 optimal konsantrasyonu belirlendikten sonra, amplifikasyon işlemi gerçekleştirildi. Hasta örnekleri Fundación Valle del Lili Üniversite Hastanesi tarafından sağlandı. Pozitif ve negatif numuneler daha önce geleneksel bir RT-PCR protokolü kullanılarak amplifiye edildi ve viral RNA daha sonra burada açıklanan protokol ve listelenen koşullar kullanılarak RT-LAMP amplifikasyonu için kullanıldı. Hasta örneklerinde N, RdRp/Hel ve RdRp genlerinin amplifikasyonu NTC'de değil, Şekil 5A,B'de gösterilmiştir. RT-LAMP'nin gelecekte POCT tasarlamak için çekici bir strateji olduğu göz önüne alındığında, bu protokoldeki amplifikasyonlar geleneksel bir termal döngüleyici ve bir su banyosunda uygulanmıştır (Şekil 6).
Protokolü standartlaştırmanın ikinci adımı, kolorimetrik stratejiyi tanımlamaktı, bu nedenle fenol kırmızısı ve nötr kırmızı, değerlendirilen ilk boyalardı; değerlendirmesi için farklı boya konsantrasyonları incelendi (Şekil 7), ancak test edilen konsantrasyonların hiçbiri ile amplifikasyondan sonra renk değişikliği gözlenmedi. Bu sonuç, her iki boyanın da pH indikatörleri olması, yani numunenin pH'ına duyarlı olmaları ile açıklanabilir, özellikle de viral RNA, bu protokolle değerlendirilen hasta numuneleri için geçerli olan Buffer TE'de ayrıştırılmışsa. Hidroksi Naftol Mavisi (HNB), polimeraz enziminin bir kofaktörü olarak amplifikasyon reaksiyonu sırasında azalacak olan Mg2+ konsantrasyonundaki değişikliklerle rengi değiştiği için araştırıldı. Bu durumda, 125 μM HNB ile reaksiyonda meydana gelen amplifikasyondan sonra hangisinin en iyi renk değişimine izin verdiğini belirlemek için farklı HNB konsantrasyonları test edildi (Şekil 8). Kolorimetrik LAMP ile N ve RdRp/Hel genleri için amplifikasyon karışımının hazırlanmasında kullanılan reaktiflerin tam bir açıklaması Tablo 5'te yer almaktadır.
Kolorimetrik tespit için en iyi koşullar belirlendikten sonra, değişen sayıda viral genoma sahip hasta örnekleri amplifiye edildi. Şekil 9 , viral genomun konsantrasyonuna göre numunelerde bir renk değişikliğinin meydana geldiği numunelerin amplifikasyonunu göstermektedir. Amplifikasyon sonuçları ayrıca agaroz elektroforezi kullanılarak görselleştirildi, bu da hasta örneklerinin amplifikasyonunu doğruladı, ancak NTC'yi doğrulamadı.
Şekil 2: LAMP tekniğini kullanarak SARS-CoV-2 genlerini çoğaltmak için kullanılan su banyosunun diyagramı. (A) Önden görünüm ve (B) üstten görünüm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Elektroforez odası düzeneği. (A) PCR ürünlerini ayırmak için kullanılan elektroforez odasının şeması. (B) Agaroz jelinin hazırlanması için iç haznenin oluşturulması. (C) Erimiş agarozun iç hazneye eklenmesi. (D) Jeli çalışma konumuna yerleştirmek için iç haznenin sökülmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Primerlerin ve Bst 3.0 enziminin amplifikasyon koşullarının standardizasyonu. (A) Her şerit, 63 °C ila 67 °C arasında değişen farklı bir gradyan sıcaklığı gösterir. Soldan sağa, moleküler ağırlık işaretleyici (MWM), Şablon Kontrolü Yok (-), şerit 1: 67 °C; şerit 2: 66,8 °C; şerit 3: 66,3 °C; şerit 4: 65,5 °C; şerit 5: 64,6 °C; şerit 6: 63,9 °C; şerit 7: 63,4 °C; şerit 8: 63 °C. (B) B1: 8,0 U/μL Bst 3,0; B2: 6.4 U/μL Bst 3.0; B3: 4.8 U/μL Bst 3.0; B4: 3.2 U/μL / Bst 3.0; 1: Şablon kontrolü yok; ve 2: hasta örneği EEDD8 (Ct = 23.39). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: SARS-CoV-2 virüsünde bulunan N ve RdRp/Hel genlerinin amplifikasyon ürünlerinin LAMP tekniği kullanılarak agaroz jel elektroforezi. (A) Çoğaltma 1 ve (B) Çoğaltma 2, burada MWM: moleküler ağırlık işaretleyicisi; 1: Şablon kontrolü yok; 2: hasta örneği E1123 (Ct = 19.95); 3: hasta örneği E1324 (Ct = 26.01); 4: hasta örneği EEDD10 (Ct = 30.09); RH: RdRp/Hel geni ve N: N geni. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: SARS-CoV-2 virüsünde bulunan RdRp geninin amplifikasyon ürünlerinin LAMP tekniği kullanılarak agaroz jel elektroforezi. Reaksiyon (A) bir termal döngüleyici ve (B) bir su banyosu sisteminde gerçekleştirildi. MPM: moleküler ağırlık işaretleyicisi; 1: Şablon kontrolü yok; 2: hasta örneği E1123 (Ct = 19.95); 3: hasta örneği E1757 (Ct = 23.67); 4: hasta örneği E1604 (Ct = 23.98); 5: hasta örneği E1245 (Ct = 25.99); 6: hasta örneği E1324 (Ct = 26.01); 7: hasta örneği EEDD7 (Ct = 26.56); 8: hasta örneği 24 (Ct = 37.99) ve R: RdRp geni. *60 dakikalık reaksiyona maruz kalan amplifikasyonları ifade eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: SARS-CoV-2 virüsünde bulunan RdRp geninin kolorimetrik algılamalı LAMP tekniği kullanılarak amplifikasyonu. Reaksiyondan önce ve (B) reaksiyondan önce ve (B) tüpler, burada 1: Şablon Kontrolü Yok; 2: hasta örneği E1123 (Ct=19.95); 3: hasta örneği E1757 (Ct=23.67); 4: hasta örneği E1324 (Ct=26.01); PR: Fenol Kırmızısı; ve NR: Nötr Kırmızı. Her boya için, son reaksiyonda dört konsantrasyon değerlendirildi (50 μM, 75 μM, 100 μM ve 120 μM). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: SARS-CoV-2 virüsünde bulunan RdRp geninin kolorimetrik LAMP tekniği ile mavi hidroksinaftol indikatörü kullanılarak amplifikasyonu. Reaksiyondan önce ve (B) reaksiyondan önce ve (B) tüpler, burada 1: Şablon Kontrolü Yok; 2: hasta örneği E1594 (Ct=20.75); 3: hasta örneği E990 (Ct=22.67); 4: hasta örneği E1245 (Ct=25.99). Bu boya için, son reaksiyonda dört konsantrasyon değerlendirildi (50 μM, 75 μM, 100 μM ve 125 μM). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Numunelerin amplifikasyonu. Tüpler (A) önce ve (B) mavi hidroksinaftol indikatörü kullanılarak LAMP ile reaksiyona sokulduktan sonra. (C) SARS-CoV-2 virüsünde bulunan N geninin amplifikasyon ürünlerinin kolorimetrik LAMP tekniği kullanılarak agaroz jel elektroforezi. MPM: moleküler ağırlık işaretleyicisi; NTC: Şablon kontrolü yok; S1: hasta örneği E1594 (Ct = 20.75); S2: hasta örneği E990 (Ct = 22.67); S3: hasta örneği E1245 (Ct = 25.99). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hedef Gen | Astar | Astar Sırası (5' → 3') | |||
| N (Zhang ve diğerleri, 2020) |
N-F3 | TGGCTACTACCGAAGAGCT | |||
| N-B3 | TGCAGCATTGTTAGCAGGAT | ||||
| N-FIP (Çip) | TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGG | ||||
| N-BIP | AGACGGCATCATATGGGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT | ||||
| N-LF | GGACTGAGATCTTTTATTTTACCGT | ||||
| N-LB | ACTGAGGGAGCCTTGAATACA | ||||
| RdRp (Başarı Havuzu) | R-F3 Serisi | CTATGGTGGTTGGCACAA | |||
| R-B3 Serisi | TTGAGCACACTCATTAGCT | ||||
| R-FIP (Türkçe) | GCATGGCTCTATCACATTTAGGATA-GTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTC | ||||
| R-BIP | ACATGCTTAGAATTATGGCCTCAC-TCTATAGAAACGGTGTGACAAG | ||||
| R-LB | TGTTCTTGCTCGCAAACATACAACG | ||||
| RdRp/Hel | RH-F3 Serisi | GGTATTGGGAACCTGAGTT | |||
| RH-B3 Serisi | GACAAGACTAATTTATGTGATGTTG | ||||
| RH-FIP | GCAAAGAACACAAGCCCCAACTTATGAGGCTATGTACACACC | ||||
| RH-BIP | TTCACAGACTTCATTAAGATGTGGTACATGGTCGTAACAGCAT | ||||
| RH-LB | GCTTGCATACGTAGACCATTCTT | ||||
Tablo 1: RT-LAMP ile SARS-CoV-2 tespiti için astar dizileri.
| Parça | Stok (μM) | Astar Karışımı 10x (μM) | Hacim (μL) |
| İleri Dış Astar (F3) | 100 | 2 | 12.5 |
| Geriye Dönük Dış Astar (B3) | 100 | 2 | 12.5 |
| İleri İç Astar (FIP) | 100 | 8 | 50 |
| Geriye Dönük İç Astar (BIP) | 100 | 8 | 50 |
| İleri Döngü (LF) | 100 | 4 | 25 |
| Geriye Döngü (LB) | 100 | 4 | 25 |
| Nükleaz İçermeyen Su* | --- | --- | 450 |
| Toplam Hacim | 625 | ||
Tablo 2: 10x RT-LAMP astar karışımının hazırlanması. RdRp gen primer karışımı, LF primerini içermez; bu nedenle, bu hacmi Nükleaz içermeyen su ile değiştirin. *Nükleaz içermeyen su yerine DEPC içinde hazırlanmış 10 mM Tris pH 8.0 %0.1 su kullanılabilir.
| Madde | Reaktif | 25 μL için nihai konsantrasyon | 1 örnek (μL) |
| 1 | 10x Tampon | 1 katı | 2.5 |
| 2 | 100 mM MgSO4 | 4 mM + 2 mM tamponda = 6 mM | 1.0 |
| 3 | 10 mM dNTP'ler | 1,4 milyon | 3.5 |
| 4 | 10x Karışım Astarları | 1x [ 0,2 μM F3/B3; 0,8 μM FIP/BIP; 0,4 μM LB] | 2.5 |
| 5 | Bst 3.0 DNA pol (8000 IU/mL) | 3.2 IU | 0.4 |
| 6 | RTx (15000 IU/mL) | 1.5 IU | 0.1 |
| 7 | Q5 DNA pol (2000 IU/mL) | 0.15 IU | 0.1 |
| 8 | Nükleaz İçermeyen Su | YOK | 11.9 |
| 9 | RNA örneği | YOK | 3.0 |
| 10 | Toplam Reaksiyon Hacmi | 25 | |
Tablo 3: RdRp gen amplifikasyon karışımının LAMP ile hazırlanması.
| Madde | Reaktif | 25 μL için nihai konsantrasyon | 1 örnek (μL) |
| 1 | 10x Tampon | 1 katı | 2.5 |
| 2 | 100 mM MgSO4 | Tamponda 6 mM + 2 mM = 8 mM | 1.5 |
| 3 | 10 mM dNTP'ler | 1,4 milyon | 3.5 |
| 4 | 10x Karışım Astarları | 1x [ 0,2 μM F3/B3; 0,8 μM FIP/BIP; 0,4 μM LF/LB] | 2.5 |
| 5 | Bst 3.0 DNA pol (8000 IU/mL) | 3.2 IU | 0.4 |
| 6 | RTx (15000 IU/mL) | 1.5 IU | 0.1 |
| 7 | Q5 DNA pol (2000 IU/mL) | 0.15 IU | 0.1 |
| 8 | Nükleaz İçermeyen Su | YOK | 11.4 |
| 9 | RNA örneği | YOK | 3.0 |
| 10 | Toplam Reaksiyon Hacmi | 25 | |
Tablo 4: LAMBAM ile N-A ve RdRp/Hel genlerinin amplifikasyon karışımının hazırlanması.
| Madde | Reaktif | 25 μL için nihai konsantrasyon | 1 örnek (μL) |
| 1 | 10x Tampon | 1 katı | 2.5 |
| 2 | 100 mM MgSO4 | 6,5 mM + 2 mM tamponda = 8,5 mM | 1.6 |
| 3 | 10 mM dNTP'ler | 1,4 milyon | 3.5 |
| 4 | 10x Karışım Astarları | 1x [ 0,2 μM F3/B3; 0,8 μM FIP/BIP; 0,4 μM LF/LB] | 2.5 |
| 5 | 1 mM Hidroksi naftol mavisi | 125 μM | 3.1 |
| 6 | Bst 3.0 DNA pol (8000 IU/mL) | 3.2 IU | 0.4 |
| 7 | RTx (15000 IU/mL) | 1.5 IU | 0.1 |
| 8 | Q5 DNA pol (2000 IU/mL) | 0.15 IU | 0.1 |
| 9 | Nükleaz İçermeyen Su | YOK | 8.2 |
| 10 | RNA örneği | YOK | 3.0 |
| 11 | Toplam Reaksiyon Hacmi | 25 | |
Tablo 5: N-A ve RdRp/Hel genlerinin amplifikasyon karışımının kolorimetrik LAMP ile hazırlanması.
| Sıcaklık | Saat |
| 66,3 °C | 60 dk |
| 80 °C | 5 dk |
| 4 °C | ∞ |
Tablo 6: RdRp, NA ve RdRp/Hel genlerinin LAMP ile amplifikasyonu için kullanılan termal koşullar.
| Boya | pH'a Bağlı | Reaksiyondan Önce Renk | Reaksiyondan Sonra Renk | Yorum | ||
| Hidroksi naftol mavisi | Hayır | Menekşe | Gök mavisi | Bu boya ile magnezyum konsantrasyonu kritiktir ve son reaksiyonda 8 mM ile 8.5 mM arasında olmalıdır. Bu sayede menekşe renginden gök mavisine renk geçişi garanti altına alınmış olur. | ||
| Kresol kırmızısı | Evet | Fuscia (Fuscia) | Sarı | RNA elüatlarında veya reaktiflerde tamponların varlığı, pH'ın düşmesini önleyebilir ve reaksiyon bittiğinde renk değişimini etkileyebilir. Bu nedenle, RNA ve primerler söz konusu olduğunda, sırasıyla elüsyon ve resüspansiyon/seyreltme için TE tamponu kullanılmaması önerilir. | ||
| Nötr Kırmızı | Evet | Soluk sarı veya Soluk turuncu | Fuscia (Fuscia) | |||
| Fenol Kırmızısı | Evet | Fuscia (Fuscia) | Sarı | |||
Tablo 7: Kolorimetrik lambanın görsel tespitinde kullanılan boyaların karşılaştırılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RT-LAMP, moleküler tanı yapmak için tamamlayıcı bir metodoloji olarak kabul edilse de, protokol standartlaştırılırken ve uygulanırken dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları ve kritik adımları da vardır.
SARS-CoV-2'nin tespiti için LAMP standardizasyonu, ana karışımdaki aşağıdaki parametreleri ve bileşenleri değerlendirdi: (a) primerlerin konsantrasyon ve hizalama sıcaklığı; (b) Enzimlerin konsantrasyonu, (c) magnezyum konsantrasyonu; (d) reaksiyon süresi; (e) BSA, DMSO, Guanidinyum Klorür gibi katkı maddelerinin dahil edilmesi; (f) Astarların tasarımı, (g) renklendirici ilavesi; (h) Kurum içinde üretilen reaksiyon tamponlarının ve rekombinant enzimlerin kullanımı.
Bu standardizasyon süreci, ikisi Zhang ve ark.14 tarafından rapor edilen ve dördü BioDx şirketi tarafından tasarlanan altı set primer ile başladı. İkincisi, mevcut çevrimiçi araçlarla sıfırdan tasarlandı ve BLAST tarafından belirlendiği üzere SARS-CoV-2'ye karşı yüksek özgüllüğü nedeniyle seçildi. Ek olarak, termodinamik değerlendirmeleri, kendi kendine amplifikasyonu destekleyen primer dimerleri veya firkete yapıları oluşturma eğiliminin daha düşük olduğunu gösterdi.
Primerlerin tekniğin standardizasyonu üzerindeki etkisi ve NTC'lerde amplifikasyonun bulunduğu önceki deneylerin sonuçları nedeniyle, N, S, RdRp ve RdRp / Hel genleri için yeni bir primer tasarımı yapıldı. Bunlar, özgüllüklerini ve kendi kendini büyüten yapılar oluşturma eğiliminin azaltılmasını garanti etmek için çeşitli biyoinformatik analizlere tabi tutuldu. Seçilen primerler, yerleşik biyoinformatik parametreleri (ΔG > -5.0 ve BLAST ile gösterilen özgüllük) karşıladı.
İn silico deneyler, primer seçimi için bir başlangıç filtresi olarak kullanılabildikleri için in vitro reaksiyonlarda gözlemlenebilecek davranışı tahmin etmede çok önemli bir role sahiptir. Ancak, bu tahminler her durumda aynı değildir; bu nedenle, kesin bir seçim parametresi olarak değil, bir başlangıç yaklaşımı olarak kullanılırlar. Teknikteki primerlerin gerçek davranışı, kolorimetri veya bir agaroz jel üzerindeki reaksiyon ve görsel değerlendirme sırasında doğrudan belirlenir. Son olarak, şüpheli veya belirsiz sonuçlar genellikle başka bir analist tarafından tekrarlanır veya atılır; çünkü tanı bağlamında kesin olmayan bir sonuç rapor edilemez.
En önemli kritik adımlardan biri, protokol geliştirilirken yüksek kontaminasyon olasılığıdır ve bu da NTC'nin amplifikasyonuna yansır. Bu, reaktifleri ve numuneleri kullanmadan önce uygun dezenfeksiyon ve temizleme prosedürlerini takip ederek, her zaman gerekli KKD'yi giyerek, aletleri laminer akış kabini içinde dikkatli bir şekilde kullanarak ve sürecin her adımını, reaktifleri karıştırmak için bir alan, değerlendirilecek numuneyi eklemek için bir diğeri ve amplifikasyon işlemini gerçekleştirmek için bir diğeri gibi özel kullanım için ayrı alanlarda geliştirmek gibi iyi laboratuvar uygulamalarını izleyerek önlenebilir.
NTC amplifikasyonuna kontaminasyon neden olabileceği gibi primer dimerizasyonu da neden olabilir. Bu nedenle, bir diğer kritik adım, astar tasarımı ve astar dimerizasyonunu önlemek için en uygun koşulların belirlenmesidir. Astar tasarım sürecinde, serbest enerji ile ölçülen ikincil yapıların oluşma olasılığını azaltan termodinamik parametrelere sahip astar setini bulmak kritik öneme sahiptir, bu nedenle seçilen astar setinin termodinamik bir değerlendirmesi gereklidir. Bu protokolde, termodinamik değerlendirme için PrimerDimer aracı12 kullanılmıştır; Multipleks inceleme seçeneği ile her bir astar, potansiyel dimer oluşumları için havuz içindeki diğer tüm primerlere karşı taranır ve Dimer Çerçeve Raporu seçeneği, her bir primer çiftinin en kararlı dimerinin çerçevesini raporlar. Bu bilgi, iyi bir astar seti seçmede çok yardımcı olur.
Ayrıca,MgS04, dNTP'ler, primerler, Bst 3.0 enzimi gibi uygun reaktif konsantrasyonunun ve Tm ve inkübasyon süresi gibi amplifikasyon parametrelerinin belirlenmesi, amplifikasyon işlemi sırasında primer dimerizasyonunu önlemek için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, amplifikasyon sırasında primer dimerlerinin oluşumunu azaltan bileşiklerin, örneğin sığır serum albümini, dimetil sülfoksit (DMSO)16 ve guanidinyum klorür17'nin eklenmesi mümkündür.
Astar tasarım sürecinin bir diğer kritik yönü, her bir astarın özgüllüğünü belirlemektir. Bu protokol için BLAST ile bu değerlendirme yapılmıştır. Bununla birlikte, filogenetik olarak ilişkili olan ancak SARS-CoV-2 ile ilgili olmayan başka bir virüs kullanılarak primer amplifikasyon işleminin özgüllüğünü değerlendirmek de önemlidir.
Öte yandan, tekniğin standardizasyonu sırasında duyarlılık ve tespit limiti (minimum saptanabilir genom sayısı) belirlenmemiştir. İlk olarak, Fundación Valle del Lili Üniversite Hastanesi tarafından teslim edilen numuneler, o sırada Kolombiya'da (2020) yürürlükte olan sıhhi acil durumdan kaynaklanan dahili kısıtlamalar nedeniyle viral kopya sayısını belirlemek için niceliklendirilmedi. Genetik materyal konsantrasyonunun tahmini, RT-qPCR'nin Cq'su ile yaklaşık olarak hesaplandı, çünkü Cq ne kadar düşükse, viral kopya sayısı o kadar yüksek olurken, Cq ne kadar yüksekse, viral kopya sayısı o kadar düşük olur. Test edilen en düşük Cq 14.81 ve en yüksek 38.93 idi ve burada hiçbir amplifikasyon ürünü görünmüyordu. Ek olarak, 2020'de Kolombiya'da kullanım için onaylanan RT-qPCR testi kalitatifti ve kantitatif değildi, yani Cq'ya göre yalnızca varlığı veya yokluğu belirledi. Cq ≥ 40 ile bir sonuç negatifti, ancak Cq < 40 pozitifti. Kolombiya'da COVID-19'un tespiti için kullanılan protokoller Berlin protokolü1, CDC 2019-Yeni Koronavirüs (2019-nCoV) Gerçek Zamanlı RT-PCR tanı paneli2 idi ve özellikle Fundación Valle del Lili Üniversite Hastanesi'nde Allplex 2019-nCoV Testi3 kullanıldı. Ne yazık ki, bu deneylere devam etmek için Fundación Valle del Lili Üniversite Hastanesi tarafından sağlanan etik kurul tarafından onaylanmış daha fazla örneğimiz yok.
Ek olarak, reaktiflerin mevcudiyeti, SARS-CoV-2'nin neden olduğu küresel bir halk sağlığı acil durumunda yeni vakaların zamanında teşhisinin önünde önemli bir engeldir. Sonuç olarak, bu protokol, ithal edilen ve maliyetli ticari kitlerin ve reaktiflerin kullanımından kaçınmak için oluşturulmuştur ve amplifikasyon tamponlarının hazırlanması bu protokolde detaylandırılmıştır. Ayrıca, kolorimetri testlerinde kullanılabilecek bazı boyalar ve kullanımları için bazı hususlar değerlendirilmiştir (Tablo 7).
Bu tanı yönteminin bazı sınırlamaları vardır, çünkü numunedeki viral genomun nicelleştirilmesine izin vermez. Ek olarak, renk tespiti subjektif bir ölçüdür çünkü protokolü gerçekleştiren kişinin görsel kapasitesine bağlıdır. Bununla birlikte, moleküler biyoloji konusunda eğitimli özel ekipman veya personel gerektirmediğinden, bu protokol farklı patojenlerin tespitine uyarlanabilir ve standartlaştırıldıktan sonra kolayca uygulanabilir. Bu nedenle, uygulaması, zamanında epidemiyolojik sürveyans yapmak için çevre 18,19,20 ve sağlık merkezleri gibi diğer örneklere genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Natalia Campillo-Pedroza, BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S. şirketinin CEO'sudur. Yazarların geri kalanı herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kolombiya'dan Sistema General de Regalías, BPIN 2020000100092 numaralı hibe ve Universidad Icesi - Convocatoria Interna, CA0413119 numaralı hibe tarafından finanse edilmiştir. MFVT ayrıca Universidad de los Andes'ten Yardımcı Doçentlik Fonları tarafından finanse edildi. Finansman sağlayan kuruluşlar, tasarımın yapılmasına, faaliyetlerin yürütülmesine, veri toplanmasına ve veri analizine ve makalenin hazırlanmasına katılmamıştır. Sars -CoV-2 örneklerinden elde edilen viral RNA için Üniversite Hastanesi Fundación Valle del Lili'ye ve el yazması hakkındaki yorumları için Dr. Alvaro Barrera-Ocampo'ya teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb DNA Ladder | SOLIS BIODYNE | 07-12-00050 | Store at -20 °C |
| 50x TAE Electrophoresis Buffer | ThermoScientific | B49 | Store at roome temperature |
| Accuris High Fidelity Polymerase | ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS | PR1000-HF-200 | It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| Agarose | PanReacAppliChem | A8963,0100 | N/A |
| Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL | New England BioLabs | M0374S/M0374L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | Store at -20 °C |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220-25G | Handle it with caution under an extraction cabinet |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use | ThermoScientific | SM0322 | Store at -20 °C |
| Hydroxy naphthol blue disodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-215156B | N/A |
| Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL | New England BioLabs | M0491S/M0491L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL | New England BioLabs | M0380S/M0380L | For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use. |
References
- World Health Organization. Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , https://covid19.who.int/ (2023).
- Ibrahim, N. K. Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications. Journal of Infection and Public Health. 13 (11), 1630-1638 (2020).
- Rojas-Gallardo, D. M., et al. COVID-19 in Latin America: Contrasting phylodynamic inference with epidemiological surveillance. (Molecular epidemiology of COVID-19 in Latin America). medRxiv. , (2020).
- Liu, R., et al. Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020. Clinica Chimica Acta. 505, 172-175 (2020).
- Kevadiya, B. D., et al.
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Li, Y., Fan, P., Zhou, S., Zhang, L. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A novel rapid detection platform for pathogens. Microbial Pathogenesis. 107, 54-61 (2017).
- Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. Journal of Microbiology. 53 (1), 1-5 (2015).
- Augustine, R., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, sensitive, specific, and cost-effective point-of-care test for coronaviruses in the context of COVID-19 pandemic. Biology (Basel). 9 (8), 182 (2020).
- Nextstrain. , https://nextstrain.org/ (2023).
- Biolabs, N.E. Neb Lamp, NEB LAMP. , https://lamp.neb.com/ (2023).
- PrimerDimer. , http://www.primer-dimer.com/ (2023).
- National Center for Biotechnology Information. Blast: Basic local alignment search tool (no date). , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ (2023).
- Zhang, Y., et al. Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP. medRxiv. , (2020).
- Lu, R., et al. Development of a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of SARS-CoV-2. Virologica Sinica. 35 (3), 344-347 (2020).
- Najafov, A., Hoxhaj, G. PCR Guru. , Elsevier, Academic Press. (2017).
- Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
- Ramírez-Chavarría, R. G., et al. Automatic analysis of isothermal amplification via impedance time-constant-domain spectroscopy: A SARS-CoV-2 case study. Chemosensors. 11 (4), 230 (2023).
- Haque, M. F. U., et al. A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan. Virus Research. 302, 198484 (2021).
- Donia, A., et al. Integration of RT-LAMP and microfluidic technology for detection of SARS-CoV-2 in wastewater as an advanced point-of-care platform. Food and Environmental Virology. 14, 364-373 (2022).
