Intrathekale Vektorverabreichung bei juvenilen Ratten über die Injektion in die Lendenwirbelsäule

Summary

Es wird ein chirurgischer Eingriff beschrieben, bei dem Injektionen in die Lendenwirbelkammer der juvenilen Ratte durchgeführt werden. Dieser Ansatz wurde für die intrathekale Verabreichung von Gentherapie-Vektoren verwendet, aber es wird erwartet, dass dieser Ansatz für eine Vielzahl von Therapeutika, einschließlich Zellen und Medikamenten, verwendet werden kann.

Abstract

Die Gentherapie ist eine leistungsstarke Technologie, um einem Patienten neue Gene zur Behandlung einer Krankheit zuzuführen, sei es zur Einführung eines funktionellen Gens, zur Inaktivierung eines toxischen Gens oder zur Bereitstellung eines Gens, dessen Produkt die Biologie der Krankheit modulieren kann. Die Verabreichungsmethode für den therapeutischen Vektor kann viele Formen annehmen, die von der intravenösen Infusion zur systemischen Verabreichung bis zur direkten Injektion in das Zielgewebe reichen. Bei neurodegenerativen Erkrankungen ist es oft wünschenswert, die Transduktion in Richtung Gehirn und/oder Rückenmark zu verzerren. Der am wenigsten invasive Ansatz, der auf das gesamte Zentralnervensystem abzielt, ist die Injektion in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), wodurch das Therapeutikum einen großen Teil des Zentralnervensystems erreichen kann. Der sicherste Ansatz, einen Vektor in den Liquor zu verabreichen, ist die lumbale intrathekale Injektion, bei der eine Nadel in die lumbale Zisterne des Rückenmarks eingeführt wird. Diese Technik, die auch als Lumbalpunktion bekannt ist, wurde häufig bei Neugeborenen und erwachsenen Nagetieren sowie in Großtiermodellen eingesetzt. Während die Technik über alle Spezies und Entwicklungsstadien hinweg ähnlich ist, erfordern subtile Unterschiede in Größe, Struktur und Elastizität des Gewebes, das den intrathekalen Raum umgibt, Anpassungen im Ansatz. In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Durchführung einer Lumbalpunktion bei juvenilen Ratten beschrieben, um einen Adeno-assoziierten Serotyp-9-Vektor zu verabreichen. Hier wurden 25-35 μl Vektor in die lumbale Zisterne injiziert, und ein grün fluoreszierender Protein-Reporter (GFP) wurde verwendet, um das Transduktionsprofil zu bewerten, das sich aus jeder Injektion ergibt. Die Vorteile und Herausforderungen dieses Ansatzes werden diskutiert.

Introduction

Das Versprechen viral vermittelter Gentherapien wurde in den letzten Jahren mit der FDA-Zulassung von Behandlungen für spinale Muskelatrophie, Netzhautdystrophie, Faktor-IX-Hämophilie, Krebs und mehr endlich verwirklicht 1,2,3,4. Unzählige weitere Therapeutika befinden sich derzeit in der Entwicklung. Die Gentherapie zielt darauf ab, ein therapeutisches Gen in die Zellen eines Patienten zu bringen. Die Produkte dieses neuen Gens können die fehlende Aktivität eines mangelhaften endogenen Gens ersetzen, ein toxisches Gen hemmen, Krebszellen abtöten oder eine andere nützliche Funktion erfüllen.

Bei Erkrankungen, die das Zentralnervensystem (ZNS) betreffen, ist es oft wünschenswert, den Gentherapievektor direkt an das Zielgewebe zu verabreichen. Nicht-systemische Ansätze bieten zwei Vorteile: Sie minimieren Off-Target-Nebeneffekte, die durch periphere Transduktion verursacht werden können, und sie reduzieren die Menge an Vektoren, die benötigt wird, um ein angemessenes Transduktionsniveau im Zielgewebe zu erreichen, erheblich⁵.

Es gibt eine Vielzahl von Ansätzen, um Gentherapie-Vektoren an das ZNS zu verabreichen. Die intraparenchymale Injektion, die Injektion eines Vektors direkt in das Rückenmark oder das Hirngewebe, kann zur Verabreichung in eine definierte Region verwendet werden. Bei vielen Erkrankungen ist jedoch eine breite Transduktion des ZNS erwünscht. Dies kann erreicht werden, indem ein Vektor in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF)⁵ abgegeben wird, die Flüssigkeit, die in und um das Gehirn und das Rückenmark fließt. Es gibt drei Hauptmethoden, um Vektoren an das CSF zu liefern. Der invasivste Ansatz ist die intrazerebroventrikuläre Verabreichung, bei der ein Bohrloch durch den Schädel gebohrt und eine Nadel durch das Gehirn in die Seitenventrikel vorgeschoben wird. Dies führt zu einer Transduktion im gesamten Gehirn. Das Verfahren kann jedoch zu intrakraniellen Blutungen führen, und der Ansatz führt in der Regel nur zu einer eingeschränkten Transduktion des Rückenmarks⁶. Die Injektion in die Cisterna magna an der Schädelbasis ist weniger invasiv, birgt aber das Risiko einer Schädigung des Hirnstamms. Während die Injektion in die Cisterna magna in der Tierforschung häufig eingesetzt wird⁵, wird sie in der Klinik nicht mehr routinemäßig angewendet⁷. Die Lumbalpunktion ist der am wenigsten invasive Ansatz für den Zugang zum Liquor. Dabei wird eine Nadel zwischen zwei Lendenwirbeln in den Lendenwirbel eingeführt.

Die Lumbalpunktion zur Vektorverabreichung wird routinemäßig bei adulten Ratten und Mäusen sowie bei neugeborenen Mäusen durchgeführt ^8,9. Die Autoren dieser Studie führten kürzlich Lumbalpunktionen bei juvenilen Ratten (im Alter von 28-30 Tagen) durch, um Adeno-assoziierte Virus-Serotyp 9 (AAV9)-Vektoren zu liefern. Bei erwachsenen Ratten wurde eine Lumbalpunktionsnadel bei Neugeborenen senkrecht zwischen den Wirbeln L3 und L4 platziert⁹. Die richtige Platzierung führt zu einem Schwanzschlag und Liquor fließt in das Nadelreservoir. Bei juvenilen Ratten konnte jedoch keiner dieser Messwerte erreicht werden. Die Autoren versuchten dann, ein Verfahren an eine adulte Maus anzupassen, bei der eine 27-G-Insulinspritze in einem Winkel zwischen L5 und L6 eingeführt wurde¹⁰. Bei erwachsenen Mäusen, die typischerweise kleiner als P28-Ratten sind, führt dies nicht zu einem Schwanzschlag, aber eine falsche Nadelplatzierung ist durch den Rückfluss des Injektats offensichtlich. Bei juvenilen Ratten führte dieser Ansatz jedoch einheitlich dazu, dass das Injektionsmuster epidural verabreicht wurde, was wahrscheinlich auf die unterschiedliche Elastizität der Gewebeschichten, die das Rückenmark umgeben, zwischen adulten Mäusen und juvenilen Ratten zurückzuführen ist. Als nächstes wurden Katheteransätze evaluiert. Konkret wurde ein Katheter durch einen Schnitt in der Dura des lumbalen Spülkastens und bis zum mittleren thorakalen Rückenmark eingeführt; Dieser Ansatz führte jedoch zu einem erheblichen Rückfluss des Injektats aus der Inzisionsstelle während der Verabreichung. Auch Versuche, den Katheter mit einer Führungsnadel perkutan in den intrathekalen Raum zu platzieren, waren erfolglos. Aufgrund der Enge der interlaminaren Breite würde der Katheter wahrscheinlich die rostrale Lamina treffen und nicht vorstoßen.

Hier wird eine Methode beschrieben, um eine erfolgreiche und reproduzierbare Lösungsabgabe über eine Lumbalpunktion bei der juvenilen Ratte zu erreichen. Dieser Ansatz kann für virale Vektoren und wahrscheinlich auch für Zellen, Pharmazeutika und andere Therapeutika verwendet werden.

Protocol

Diese Studie wurde vom Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. In der vorliegenden Studie wurden Sprague-Dawley-Ratten (28-30 Tage alt, Masse im Bereich von etwa 90-135 g, Männchen und Weibchen) verwendet.

1. Vorbereitung des Vektors

1. Tauen Sie den AAV9-Vektor (siehe Materialtabelle) zu Beginn des Vorgangs auf Eis auf.
2. Zentrifugieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Vektor kurz in einer Tischzentrifuge, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens befindet.
3. Schnippen Sie vorsichtig mit dem Mikrozentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, dass die Lösung gut vermischt ist.

2. Vorbereitung des Auffangkäfigs

1. Stellen Sie einen sauberen Käfig so auf eine Heizdecke (siehe Materialtabelle), dass nur die Hälfte des Käfigs mit der Decke in Kontakt kommt.
2. Stellen Sie die Temperatur der Decke auf ~37 °C ein.

3. Vorbereitung der chirurgischen Plattform

1. Erwärmen Sie ein isothermes Pad (siehe Materialtabelle) in der Mikrowelle oder im Wasserbad auf 39 °C, so dass der Inhalt flüssig wird.
2. Legen Sie das isotherme Pad auf die Operationsplattform und decken Sie es mit einer sauberen, saugfähigen Bankunterlage ab.

4. Vorbereitung der Tiere

1. Betäuben Sie die Ratten mit Isofluran in einer durchsichtigen Box (nach institutionell anerkannten Protokollen). Beginnen Sie die Anästhesieeinleitung mit 5 % Isofluran und verringern Sie die Anästhesie um 1 % pro Minute, bis Sie 2 % erreichen. Halten Sie das Tier für weitere 3 Minuten bei 2 %.
2. Schieben Sie den Kasten mit dem Tier zu einem Abzug und öffnen Sie den Kasten.
   HINWEIS: Dies begrenzt die Exposition des Chirurgen gegenüber dem Anästhetikum.
3. Entfernen Sie die Haare vom Rücken des Tieres mit einer elektrischen Haarschneidemaschine.
   HINWEIS: Alternativ kann eine Enthaarungscreme oder ein manueller Rasierer und Rasierschaum verwendet werden.
4. Platzieren Sie das Tier auf der Operationsplattform mit der Schnauze im Anästhesie-Nasenkonus.
   HINWEIS: Das Tier kann beginnen, das Bewusstsein wiederzuerlangen, während das Fell von der Operationsstelle entfernt wird. In diesem Fall betäuben Sie es erneut wie oben beschrieben.
5. Tragen Sie eine befeuchtende Augensalbe auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen der Hornhaut während des Eingriffs zu verhindern.
6. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit drei abwechselnden Anwendungen von Povidon-Jod- und Isopropanol-Tüchern.
7. Injizieren Sie das/die Analgetikum(e) subkutan.
   HINWEIS: Buprenorphin wird im Allgemeinen in einer Dosis von 0,01-0,05 mg/kg alle 12 Stunden verabreicht. Alternativ kann eine langsam freisetzende Form dieses Arzneimittels einmal mit 1 mg/kg verabreicht werden, um eine angemessene Schmerzkontrolle für 72 Stunden zu gewährleisten. Wenden Sie sich an die IACUC der Institution, um deren Richtlinien zur Schmerzbehandlung zu erhalten.
8. Injizieren Sie 100 μl 1 % Lidocain subkutan über den Dornfortsätzen L2 bis L6, um eine Lokalanästhesie durchzuführen.
9. Legen Sie eine Rolle Papiertuch oder eine Röhre mit einem Durchmesser von 1,5 cm unter das Tier, gerade rostral zu den Hüften. Dies hilft, die Wirbelsäule zu beugen, was es einfacher macht, die Nadel zwischen den beiden Lamellen einzuführen.
10. Legen Sie ein Fenstertuch (siehe Materialtabelle) auf das Tier und zentrieren Sie das Fenster über der Lendenwirbelsäule.

5. Freilegung der Lendenwirbelsäule

1. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie jede der Pfoten des Tieres kneifen und darauf achten, ob es keine Entzugsreaktion gibt.
2. Mache mit einer Skalpellklinge #11 einen ca. 3 cm langen Schnitt in der Haut entlang der Mittellinie von L2 bis L6.
3. Lösen Sie die Haut vom Muskel, indem Sie eine steril gebogene chirurgische Schere zwischen Muskel und Haut einführen und dann die Spitzen öffnen.
4. Entfernen Sie die Faszie, die die Dornfortsätze L2-L5 bedeckt.

6. Beladung der Spritze

1. Pipettieren Sie 25-35 μl des Vektors (um die gewünschte Dosis zu erreichen) in den Deckel eines sterilen Mikrozentrifugenröhrchens.
2. Ziehen Sie das gesamte Volumen in die Insulinspritze.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass sich während dieses Vorgangs keine Luft ansaugt.

7. Durchführung der Injektion

1. Identifizieren Sie die Dornfortsätze L5 und L4.
   HINWEIS: L6 sitzt direkt zwischen den beiden Beckenkämmen, und sein Dornfortsatz sollte durch Sondieren mit einem stumpfen Instrument leicht zu identifizieren sein. Das Instrument kann dann sanft über den Rücken geführt werden, um die Grenzen der Prozesse L5 und L4 zu finden.
2. Legen Sie eine Hand so auf, dass der Daumen sanft auf dem Schwanz und einem Bein des Tieres aufliegt. Verwenden Sie einen Finger, um die Spritze zu fixieren.
3. Positionieren Sie die Nadel der Spritze so, dass sie sich links vom Dornfortsatz L5 befindet und mit seinem kaudalen Ende ausgerichtet ist. Positionieren Sie die Spritze so, dass sie etwa 30° von der Mittellinie und 30° von der Tischebene entfernt ist.
   HINWEIS: Es kann hilfreich sein, ein Operationsmikroskop zu verwenden, um Orientierungspunkte besser zu identifizieren und die Nadelspitze zu positionieren.
4. Schieben Sie die Spritzennadel ca. 8 mm nach vorne, über die Oberseite der L5-Lamina und dann unter der L4-Lamina in die Lendenzisterne, bis der Knochen getroffen wird. Die richtige Platzierung führt zu einem Zucken des Beins und/oder des Schwanzes, das durch den Daumen, der auf dem Bein/Schwanz ruht, gesehen oder gefühlt werden kann. Wenn es nicht zuckt, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie den Vorgang von der linken Seite aus. Wenn immer noch kein Zucken zu hören ist, wiederholen Sie den Vorgang zwischen L4/L3 und L3/L2 nach Bedarf.
5. Drücken Sie den Kolben langsam für ca. 5 s.
   HINWEIS: Während der Injektion kann es zu einem Zucken im Bein oder Schwanz kommen.
6. Halten Sie die Spritze nach dem vollständigen Drücken des Kolbens etwa 30 s lang an Ort und Stelle, damit sich der Druck ausgleichen kann und der Rückfluss des Injektats beim Zurückziehen der Nadel minimiert wird.
7. Entfernen Sie langsam die Nadel.

8. Verschluss des Schnittes

1. Nähern Sie sich den Rändern des Schnitts.
2. Beginnen Sie an einem Ende der Wunde und verwenden Sie eine 4-0-Naht (siehe Materialtabelle) oder chirurgische Klammern, um den Schnitt zu schließen.

9. Wiederherstellung und Überwachung

1. Setzen Sie das Tier in den vorgewärmten Käfig.
2. Kontrollieren Sie das Tier mindestens alle 15 Minuten, bis es vollständig gehfähig ist.
   HINWEIS: Dies sollte zwischen 15 Minuten und 45 Minuten dauern.
3. Führen Sie in den nächsten drei Tagen mindestens täglich Gesundheitschecks durch. Geben Sie Analgetika für die ersten 2 Tage nach der Operation oder wie von der IACUC gefordert.
4. Eine Woche nach der Operation entfernen Sie die Nähte oder Klammern.

10. Follow-up-Verfahren

HINWEIS: Um die Genauigkeit der Injektionstechnik zu bestimmen, injizieren Sie Trypanblau-Farbstoff wie oben beschrieben und euthanasieren Sie das Tier sofort (gemäß institutionell anerkannten Protokollen) und führen Sie eine Laminektomie durch, um das Ergebnis zu visualisieren.

1. Während das Tier unter Narkose bleibt, euthanasieren Sie es, indem Sie eine tödliche Dosis Pentobarbital durch intraperitoneale Injektion in einer Dosis von 150 mg/kg verabreichen.
2. Sobald die Atmung und die Herzaktivität aufhören, öffnen Sie die Brusthöhle, um den Tod zu gewährleisten. Verlängern Sie den chirurgischen Schnitt über den Rücken bis zum Nacken.
3. Machen Sie einen 4 cm langen Schnitt in den Muskel parallel zur Wirbelsäule auf beiden Seiten der Dornfortsätze und halten Sie sich dabei so nah wie möglich an den Fortsätzen.
4. Entfernen Sie mit einer feinen Zange oder Schere den Muskel zwischen den Dornfortsätzen.
5. Die Dornfortsätze von L6 bis zur unteren Brustwirbelsäule werden mit Hilfe eines Rongeurs entfernt (siehe Materialtabelle). Vermeiden Sie Drehbewegungen, da diese die Rongeure beschädigen können.
6. Führen Sie die untere Spitze des Rongeur unter die L5-Lamina ein und entfernen Sie den Knochen über dem Rückenmark, indem Sie mehrere "Bisse" aus ihm herausnehmen.
   HINWEIS: Das Zurückziehen des L6-Dornfortsatzes kann das Einführen der Spitze des Rongeurs erleichtern. Es muss darauf geachtet werden, dass das Rückenmark nicht geschädigt wird.
7. Erweitern Sie die Laminektomie mindestens vier Laminae rostral. Untersuchen Sie die Innenseite der Schichten auf Anzeichen von Farbstoffen, die auf eine fehlgeschlagene Injektion hinweisen können.

Representative Results

Um die Genauigkeit der Injektionstechnik zu bestimmen, wurde ein Farbstoff, Trypanblau, als Surrogat für das Therapeutikum verwendet. Dieser Farbstoff bindet leicht an Proteine, so dass er in der Regel in der Struktur bleibt, in die er injiziert wurde. Dies bedeutet, dass der Farbstoff die Verteilung des Therapeutikums nach der Injektion möglicherweise nicht genau vorhersagt. Es wird einfach verwendet, um die Genauigkeit der Injektion anzuzeigen. Bei erfolgreicher Einführung in den Lumbalspülkasten bindet Trypanblau an die Dura mater und färbt den Umfang des Rückenmarks blau. Wenn die Nadel jedoch nicht in die Dura mater eindringt, landet der Farbstoff im Epiduralraum. Sowohl die Dura mater als auch das umgebende Gewebe (die Oberfläche des Knochens und die Bänder und Muskeln, die die Lamellen verbinden) werden blau gefärbt. Diese Muster sind mit bloßem Auge leicht zu erkennen.

Der Unterschied zwischen richtig und falsch verabreichter Injektion ist schwer zu beurteilen, wenn man einfach einen Querschnitt durch das Rückenmark und die Wirbelsäule macht. Stattdessen wird empfohlen, eine Laminektomie mit einem Paar Rongeure durchzuführen, das an der L5-Lamina beginnt und sich rostral bewegt. Es muss darauf geachtet werden, dass die Dura mater dabei nicht beschädigt wird. Der Einsatz des Präpariermikroskops erleichtert diesen Prozess. Abbildung 1 zeigt Vergleichsbeispiele für erfolgreiche Injektionen und nur teilweise erfolgreiche Injektionen. Bei einer erfolgreichen Injektion wird beim Zurückziehen der Nadel wenig bis gar kein Rückfluss entlang der Nadelbahn beobachtet. Nach einer erfolgreichen Injektion zeigt sich bei der Entfernung der Lamina, um das Rückenmark freizulegen, Trypanblau im Rückenmark, aber nicht auf der Oberfläche des Knochens (Abbildung 1A). Der Farbstoff ist nach erfolgreicher Injektion auch am Hirnstamm und am Kleinhirn sichtbar (Abbildung 1B). Im Gegensatz dazu zeigt sich eine teilweise erfolgreiche Injektion durch einen signifikanten Rückfluss von Farbstoff in den Nadeltrakt während des Injektionsprozesses und/oder durch sichtbare Anzeichen von Farbstoff auf dem Knochen (Abbildung 1C).

Unter Verwendung des obigen Verfahrens wurden 28 μl eines AAV9-Vektors, der ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert, in einer Konzentration von 3 x^{10 13} Vektorgenomen/ml injiziert, für eine Gesamtdosis von 8,4 x^{10 11} Vektorgenomen/Tier. Vier Wochen später wurden die Tiere eingeschläfert und mit 4 % Paraformaldehyd¹⁰ durchblutet. Das Gehirn und das Rückenmark wurden dann entnommen und für den Gefrierschnitt vorbereitet. Es wurden 40 μm dicke Abschnitte erhalten und für GFP gefärbt. Abbildung 2 zeigt Beispiele für das Transduktionsmuster, das mit diesem Vektor erhalten wurde. Die Transduktion war im Allgemeinen im Rückenmark am höchsten, insbesondere im Lendenwirbelbereich (Abbildung 2A-C), wahrscheinlich aufgrund der Nähe zur Injektionsstelle. Die Transduktion des Gehirns wurde erreicht (Abbildung 2D-F), aber wie erwartet war sie tendenziell begrenzter als das, was im Rückenmark zu sehen war.

Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu veranschaulichen, die von einem einzelnen, erfahrenen Chirurgen mit einer einzigen Viruscharge erzielt wurden, werden in Abbildung 3 bzw. Abbildung 4 gefärbte Abschnitte des Kleinhirns und der Hirnrinde von jeder der 15 Ratten dargestellt, die für diese Studie injiziert wurden. Die gefärbten Abschnitte des zervikalen Rückenmarks sind auch bei 7 dieser 15 Ratten dargestellt (Abbildung 5). Natürlich kann das Ausmaß der Hirntransduktion bei unterschiedlichen Dosen, Vektorchargen und Chirurgen eine noch größere Variabilität aufweisen¹⁰.

Abbildung 1: Freilegung des Rückenmarks nach einer Injektion des Farbstoffs. Nach der Injektion von Trypanblau wurden Laminektomien durchgeführt. (A) Das Rückenmark wird bei einer korrekt verabreichten Injektion blau gefärbt, und es ist kein Farbstoff auf dem Knochen zu sehen, der während der Laminektomie entfernt wurde (Pfeile). (B) Der Farbstoff kann auch um den Hirnstamm herum beobachtet werden. (C) Bei einer Injektion, bei der es während der Injektion zu einem signifikanten Reflux kam, befindet sich weniger Farbstoff im Rückenmark und der Farbstoff ist auf der Oberfläche des Knochens vorhanden (Pfeile). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiele für Transduktionsmuster, die nach intrathekaler Verabreichung von AAV9-GFP erreicht wurden. 40 μm mächtige Schnitte des (A) zervikalen, (B) thorakalen und (C) lumbalen Rückenmarks wurden immunhistochemisch auf GFP gefärbt (schwarze Färbung). Auf allen Ebenen wurde ein hohes Maß an Transduktion der grauen Substanz beobachtet. (D) Im Gegensatz dazu weist das Gehirn eine spärlichere Gesamttransduktion auf. Die linken und rechten Felder werden in (E) bzw. (F) vergrößert. (E) Der Großteil der Färbung wird im Kleinhirn beobachtet, hauptsächlich in Purkinje-Neuronen (Pfeile). (F) Neuronen (Pfeile) und Astrozyten (Pfeilspitzen) werden innerhalb der Großhirnrinde transduziert. Maßstabsleisten: (A-C) 325 μm; (D) 5 mm; und (E,F) 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Reproduzierbarkeit der Transduktion im Kleinhirn. Reproduzierbarkeit der Transduktion im Kleinhirn von 15 Ratten, die vom selben Chirurgen mit der gleichen Dosis und Charge des Virus injiziert wurden. Maßstab: 1 mm. Die Zahlen auf den Bildern geben die Ratten-ID-Nummern ("Wurf") an. Individuum"). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Reproduzierbarkeit der Transduktion im Kortex. Reproduzierbarkeit der Transduktion in der Hirnrinde von 15 Ratten, die vom selben Chirurgen mit der gleichen Dosis und Menge des Virus injiziert wurden. Maßstabsleiste: 500 μm. Die Zahlen auf den Bildern geben die Ratten-ID-Nummern ("Wurf") an. Individuum"). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Reproduzierbarkeit der Transduktion im zervikalen Rückenmark. Reproduzierbarkeit der Transduktion im zervikalen Rückenmark von 7 Ratten, die vom selben Chirurgen mit der gleichen Dosis und Menge des Virus injiziert wurden. Maßstabsleiste: 500 μm. Die Zahlen auf den Bildern geben die Ratten-ID-Nummern ("Wurf") an. Individuum"). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Das ZNS ist von den unterschiedlichsten Erkrankungen betroffen. Die Bereitstellung einer funktionellen Kopie des relevanten Gens über einen viralen Vektor ist eine attraktive Behandlungsstrategie für solche, die rezessiv und monogen Natur sind, wie z. B. spinale Muskelatrophie. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) schließt jedoch die meisten intravenös verabreichten Gentherapievektoren aus¹¹. Diejenigen, die die BHS überwinden können, wie z. B. AAV9, müssen in hohen Dosen verabreicht werden, um den Vektorverlust aufgrund der peripheren Transduktion^{zu überwinden 12}. Auch das Alter ist ein Hindernis. Die Exposition gegenüber den verschiedenen AAV-Serotypen in der Umwelt nimmt mit dem Alter^{von 13} Jahren zu und führt häufig zur Produktion von Antikörpern, die therapeutische Vektoren neutralisieren können¹⁴. Daher ist die intravenöse Verabreichung von Gentherapievektoren für ZNS-Erkrankungen im Allgemeinen auf Säuglinge beschränkt und wird bei Patienten, die später im Leben diagnostiziert werden, nicht angewendet.

Bei älteren Patienten kann die direkte Vektorinjektion in den Liquor zu einer breiten Transduktion im ZNS führen, wobei sowohl die BHS als auch bereits vorhandene Anti-AAV-Antikörper umgangen^{werden 15}. Da dieser Ansatz zielgerichtet ist, können auch niedrigere Vektordosen verwendet werden. Im klinischen Umfeld gibt es zwei primäre Ansätze: (1) die Lumbalpunktion und (2) die Injektion in die Seitenventrikel. Letzteres birgt ein höheres Risiko, sorgt aber im Allgemeinen für eine größere Gehirntransduktion. Die Lumbalpunktion ist sicherer, aber die Transduktion ist in Richtung Rückenmark verzerrt. Die Hirntransduktion könnte verbessert werden, indem der Patient in die Trendelenburg-Position gebracht wird, aber die Daten dazu sind gemischt^16,17. Die Verwendung eines Katheters, um die Cisterna magna über eine Lumbalpunktion zu erreichen, kann in der Klinik eine bessere Option sein, befindet sich jedoch in einem frühen Stadium der Anwendung⁵. Es kann weitere Herausforderungen bei der Übertragung von Ansätzen, die in Tiermodellen erarbeitet wurden, in die Klinik geben, wie z. B. Vektorverlust aufgrund von Liquorleckage¹⁸ und Toxizität in den Spinalganglien¹⁹.

Die meisten Studien zu ZNS-gerichteten Therapien, die an Nagetieren durchgeführt werden, verwenden Neugeborene oder erwachsene Tiere (>Alter von 60 Tagen). Neugeborene haben den Vorteil einer geringen Körpergröße, die höhere wirksame Dosen ermöglicht, und eines unreifen Immunsystems, wodurch die Komplikationen einer Immunantwort gegen das Therapeutikum vermieden werden. In Bezug auf die Entwicklung des Gehirns repräsentiert eine neugeborene Maus oder Ratte jedoch besser ein fötales Stadium beim Menschen. Für Therapien, die für Kinder im Alter von 5 bis 10 Jahren bestimmt sind, ist die juvenile Ratte (25-35 Tage alt) ein besseres Modell in Bezug auf die neurologische Entwicklung²⁰. Da ein Verfahren zur intrathekalen Injektion für juvenile Ratten bisher nicht beschrieben worden war und sich die für adulte Mäuse und Ratten etablierten Methoden bei Ratten in diesem Alter als unwirksam erwiesen hatten, wurde der oben beschriebene Ansatz entwickelt. Um es klar zu sagen: Jungratten sind nicht nur kleiner als erwachsene Ratten, sondern können sich auch in der Elastizität der Dura unterscheiden, die das Rückenmark schützt, so dass ein Verfahren, das diese Schicht bei einer erwachsenen Ratte durchstechen kann, bei einem Jungratten unwirksam ist.

Beim Erlernen der intrathekalen Injektion bei juvenilen Ratten ist die Verwendung eines Farbstoffs (z. B. Trypanblau) als Surrogat für das Therapeutikum erforderlich, und der Benutzer sollte sehr zuversichtlich sein, dass er das Verfahren erfolgreich und reproduzierbar durchführen kann, bevor er eine Studie mit einem Therapeutikum beginnt. Um die Technik zu beherrschen, muss man üben, um Erfahrung damit zu sammeln, wie sich die Spritze anfühlt, wenn die Flugbahn auf dem Ziel oder außerhalb des Ziels verläuft. Es gibt zwei häufige Fehler. Wenn der Annäherungswinkel zu flach ist, trifft die Nadel auf die Oberseite einer der Laminae oder die Rückseite der rostralen Lamina. Es gibt kein Zucken und die Entfernung, die die Nadel zurücklegt, beträgt einige Millimeter weniger als 8 mm. Ist der Annäherungswinkel zu groß, besteht die Gefahr, dass die Nadel zwischen den beiden Laminae hindurchgeht und in die Bauchhöhle eindringt. In diesem Fall bewegt sich die Nadel viel weiter als 8 mm. Entfernen Sie in diesem Fall die Nadel, positionieren Sie sie neu und versuchen Sie es erneut. In den wenigen Fällen, in denen dies passiert ist, hat das vorübergehende Eindringen in die Bauchhöhle um einige Millimeter vor dem Herausziehen und Neupositionieren den Tieren keinen offensichtlichen dauerhaften Schaden zugefügt.

Es wurde festgestellt, dass die Beobachtung einer körperlichen Reaktion auf die Platzierung der Nadel entscheidend ist, um mit diesem Verfahren eine Reproduzierbarkeit mit einer hohen Erfolgsrate zu erreichen. Wenn es kein Ansprechen gab, war die Erfolgsrate für die Injektion gering. In einigen Fällen benötigte ein Tier jedoch Versuche an mehreren Stellen, um eine Reaktion zu erzielen, und Spuren von Farbstoff wurden in einer oder mehreren der vorherigen Nadelspuren beobachtet. Im Epiduralraum wurde kein Farbstoff beobachtet, was darauf hindeutet, dass einige der vorangegangenen Nadelstiche in die Dura eingedrungen waren, ohne ein Zucken des Schwanzes oder der Beine hervorzucken. Da der Reflux minimal war (ähnlich dem, was in der Nadelspur der Injektion beobachtet wird), wird angenommen, dass die Wirkung früherer Nadelstiche auf die Wirksamkeit der Verabreichung in diesen Fällen vernachlässigbar war.

Sobald man die Beherrschung der Verabreichungstechnik erlangt hat, kann eine zweite, nicht-chirurgische Herausforderung auftreten. Insbesondere bei erwachsenen Ratten (im Alter von ~70 Tagen) kann die Wirksamkeit von AAV9-Vektoren für die intrathekale Verabreichung an das Rückenmark und das Gehirn von Charge zu Charge erheblich variieren, selbst wenn sie vom selben Vektorkern erzeugt werden. Einige Chargen funktionieren wie erwartet und führen zu einer Transduktion in der grauen Substanz des Rückenmarks entlang ihrer Länge. Andere hingegen können die graue Substanz nicht durchdringen und transduzieren hauptsächlich die dorsalen Wurzelganglien¹⁰. Die Ursache für diese Variabilität ist unklar, da die Vektoren in vitro und bei direkter Injektion in das Rückenmark potent sind. Es wird empfohlen, eine Pilotstudie mit 3-4 Tieren mit einer neuen Viruscharge durchzuführen, um zu bestätigen, dass die neue Charge wie erwartet funktioniert, bevor eine große Studie begonnen wird. Die Wirksamkeit kann entweder durch immunhistochemische oder Immunfluoreszenzfärbung des Proteintransgenprodukts oder durch Quantifizierung der Menge an transgenen mRNA- oder Vektorgenomen mittels quantitativer PCR oder ddPCR²¹ bestimmt werden. Zusätzlich zu den unbekannten Variablen, die Viruschargen unterscheiden, können kleine Unterschiede im Alter der Tiere, dem Injektionsvolumen, der Geschwindigkeit der Verabreichung und der Vektorkonzentration zu Variabilität in den Ergebnissen führen. Vor Beginn einer großen Studie müssen sie möglicherweise für jedes Virus oder jeden anderen Therapeutikakandidaten optimiert werden.

Nach der Schulung kann ein erfahrener Chirurg das intrathekale Injektionsverfahren einer juvenilen Ratte innerhalb von etwa 30 Minuten abschließen, von der Einleitung der Anästhesie bis zum Beginn der Erholungsphase. So können große Kohorten in kurzer Zeit behandelt werden. Auch die Genesung von der Operation ist schnell. Die meisten Tiere laufen normal innerhalb von 20-30 min. Nach der Durchführung von mehr als 200 dieser Operationen wurden keine unerwünschten Auswirkungen dieses Verfahrens festgestellt.

Schließlich sind die Minimierung des Stresses der Tiere und die Gewährleistung des Tierschutzes bei chirurgischen Eingriffen von größter Bedeutung. Daher ist die richtige Anwendung von Anästhetika und Analgetika erforderlich, und die Körpertemperatur muss während des Eingriffs und bis zur vollständigen Genesung des Tieres von der Anästhesie aufrechterhalten werden. Die zuständigen Aufsichtsbehörden und das veterinärmedizinische Personal der verschiedenen Einrichtungen können unterschiedliche Anforderungen und Empfehlungen zu diesen Themen haben. Die in diesem Verfahren beschriebene Verwendung von Anästhetika und Analgetika wurde in Absprache mit den Tierärzten der Emory University und den Mitarbeitern der IACUC entwickelt. Forscher sollten eng mit ihren örtlichen Tierärzten und der IACUC zusammenarbeiten, um die erforderlichen Ziele zu erreichen.

Dieses Verfahren unterliegt gewissen Einschränkungen. Die hier beschriebene Methode wurde für die Anwendung bei juvenilen Ratten entwickelt, und unzählige strukturelle und andere Unterschiede zwischen Menschen und Ratten können die Übertragung dieser Verfahren auf den Menschen einschränken. Der Sinn der Ermöglichung der lumbalen intrathekalen Injektion eines Therapeutikums bei juvenilen Ratten besteht darin, die Verwendung des Modells für juvenile Ratten zur Prüfung der Wirksamkeit des therapeutischen Behandlungskandidaten zu erleichtern - auch wenn die genaue Art der Verabreichung für die Anwendung bei Patienten geändert werden müsste.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection