Summary
किशोर चूहे के काठ का कुंड में इंजेक्शन करने के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग जीन थेरेपी वैक्टर के इंट्राथेकल वितरण के लिए किया गया है, लेकिन यह अनुमान लगाया गया है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग कोशिकाओं और दवाओं सहित विभिन्न प्रकार के चिकित्सीय के लिए किया जा सकता है।
Abstract
जीन थेरेपी बीमारी के इलाज के लिए एक मरीज को नए जीन देने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, चाहे वह एक कार्यात्मक जीन पेश करना हो, एक विषाक्त जीन को निष्क्रिय करना हो, या एक जीन प्रदान करना हो जिसका उत्पाद रोग के जीव विज्ञान को संशोधित कर सके। चिकित्सीय वेक्टर के लिए वितरण विधि कई रूप ले सकती है, प्रणालीगत वितरण के लिए अंतःशिरा जलसेक से लेकर लक्ष्य ऊतक में सीधे इंजेक्शन तक। न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए, अक्सर मस्तिष्क और/या रीढ़ की हड्डी की ओर पारगमन को तिरछा करना वांछनीय होता है। पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को लक्षित करने के लिए कम से कम आक्रामक दृष्टिकोण में मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में इंजेक्शन शामिल है, जिससे चिकित्सीय केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एक बड़े अंश तक पहुंच सकता है। सीएसएफ में एक वेक्टर देने का सबसे सुरक्षित तरीका काठ का इंट्राथेकल इंजेक्शन है, जहां रीढ़ की हड्डी के काठ का कुंड में एक सुई पेश की जाती है। यह तकनीक, जिसे काठ का पंचर के रूप में भी जाना जाता है, का व्यापक रूप से नवजात और वयस्क कृन्तकों और बड़े पशु मॉडल में उपयोग किया जाता है। जबकि तकनीक प्रजातियों और विकास के चरणों में समान है, इंट्राथेकल स्पेस के आसपास के ऊतकों के आकार, संरचना और लोच में सूक्ष्म अंतर के लिए दृष्टिकोण में आवास की आवश्यकता होती है। यह आलेख एक एडेनो-जुड़े सीरोटाइप 9 वेक्टर देने के लिए किशोर चूहों में काठ का पंचर करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। यहां, वेक्टर के 25-35 माइक्रोन को काठ का कुंड में इंजेक्ट किया गया था, और प्रत्येक इंजेक्शन से उत्पन्न पारगमन प्रोफ़ाइल का मूल्यांकन करने के लिए एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) रिपोर्टर का उपयोग किया गया था। इस दृष्टिकोण के लाभों और चुनौतियों पर चर्चा की जाती है।
Introduction
वायरल मध्यस्थता जीन चिकित्सा का वादा अंत में रीढ़ की हड्डी पेशी शोष के लिए उपचार की एफडीए अनुमोदन के साथ हाल के वर्षों में एहसास हुआ है, रेटिना डिस्ट्रोफी, कारक IX हीमोफिलिया, कैंसर, और अधिक 1,2,3,4. अनगिनत अन्य चिकित्सीय वर्तमान में विकास में हैं। जीन थेरेपी का उद्देश्य रोगी की कोशिकाओं को चिकित्सीय जीन देना है। इस नए जीन के उत्पाद एक कमी अंतर्जात जीन से लापता गतिविधि को प्रतिस्थापित कर सकते हैं, एक विषाक्त जीन को रोक सकते हैं, कैंसर कोशिकाओं को मार सकते हैं, या कुछ अन्य लाभकारी कार्य प्रदान कर सकते हैं।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को प्रभावित करने वाली बीमारियों के लिए, जीन थेरेपी वेक्टर को सीधे लक्ष्य ऊतक तक पहुंचाना अक्सर वांछनीय होता है। गैर-प्रणालीगत दृष्टिकोण दो लाभ प्रदान करते हैं: वे परिधीय पारगमन के कारण होने वाले ऑफ-टारगेट साइड इफेक्ट्स को कम करते हैं, और वे लक्ष्य ऊतक 5 में पारगमन के पर्याप्त स्तर को प्राप्त करने के लिए आवश्यक वेक्टर की मात्रा को बहुत कम करतेहैं।
सीएनएस को जीन थेरेपी वैक्टर देने के लिए कई तरह के दृष्टिकोण हैं। इंट्रापैरेन्काइमल इंजेक्शन, रीढ़ की हड्डी या मस्तिष्क के ऊतकों में सीधे एक वेक्टर का इंजेक्शन, एक परिभाषित क्षेत्र में डिलीवरी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, कई बीमारियों के लिए, सीएनएस का व्यापक पारगमन वांछित है। यह मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ)5को एक वेक्टर देकर पूरा किया जा सकता है, तरल पदार्थ जो मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में और उसके आसपास बहता है। सीएसएफ को वैक्टर देने के तीन प्राथमिक तरीके हैं। सबसे आक्रामक दृष्टिकोण इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर डिलीवरी है, जिसमें खोपड़ी के माध्यम से एक गड़गड़ाहट छेद ड्रिलिंग और पार्श्व निलय में मस्तिष्क के माध्यम से एक सुई को आगे बढ़ाना शामिल है। यह पूरे मस्तिष्क में पारगमन पैदा करता है। हालांकि, प्रक्रिया इंट्राक्रैनील रक्तस्राव का कारण बन सकती है, और दृष्टिकोण आम तौर पर रीढ़ की हड्डी6 के केवल सीमित पारगमन का उत्पादन करता है। खोपड़ी के आधार पर सिस्टर्न मैग्ना में इंजेक्शन कम आक्रामक है, लेकिन ब्रेनस्टेम को नुकसान का जोखिम उठाता है। जबकि अक्सर पशु अनुसंधान5 में प्रयोग किया जाता है, कुंड मैग्ना में इंजेक्शन अब क्लिनिक7 में नियमित रूप से उपयोग नहीं किया जाता है। सीएसएफ तक पहुंचने के लिए काठ का पंचर सबसे कम आक्रामक दृष्टिकोण है। इसमें दो काठ कशेरुकाओं के बीच और काठ का कुंड में एक सुई रखना शामिल है।
वेक्टर प्रसव के लिए काठ का पंचर नियमित रूप से वयस्क चूहों और चूहों में और नवजात चूहों 8,9 में किया जाता है. इस अध्ययन के लेखकों ने हाल ही में एडेनो-जुड़े वायरस सीरोटाइप 9 (एएवी 9) वैक्टर देने के लिए किशोर चूहों (28-30 दिन की उम्र) में काठ का पंचर किया। वयस्क चूहों में, एक नवजात काठ का पंचर सुई L3 और L4 कशेरुकाओं9 के बीच लंबवत रखा गया था. उचित प्लेसमेंट के परिणामस्वरूप एक टेल फ्लिक और सीएसएफ सुई जलाशय में बहता है। किशोर चूहों में, हालांकि, इनमें से कोई भी रीड-आउट हासिल नहीं किया जा सका। लेखकों तो एक 27 जी इंसुलिन सिरिंज एल 5 और एल 610 के बीच एक कोण पर डाला का उपयोग कर एक वयस्क माउस प्रक्रिया को अनुकूलित करने का प्रयास किया. वयस्क चूहों में, जो आम तौर पर P28 चूहों से छोटे होते हैं, यह एक पूंछ झटका का उत्पादन नहीं करता है, लेकिन गलत सुई प्लेसमेंट इंजेक्शन के बैकफ्लो से स्पष्ट है। किशोर चूहों में, हालांकि, इस दृष्टिकोण ने समान रूप से इंजेक्शन को एपिड्यूरल रूप से वितरित किया जा रहा है, संभवतः वयस्क चूहों और रीढ़ की हड्डी के आसपास ऊतक परतों के किशोर चूहों के बीच अलग-अलग लोच के परिणामस्वरूप होता है। कैथेटर दृष्टिकोण अगले मूल्यांकन किया गया. विशेष रूप से, एक कैथेटर काठ का कुंड के ड्यूरा में और मध्य वक्ष रीढ़ की हड्डी तक एक चीरा के माध्यम से पेश किया गया था; हालांकि, इस दृष्टिकोण प्रसव के दौरान चीरा साइट से वापस इंजेक्शन के पर्याप्त भाटा के लिए नेतृत्व. एक गाइड सुई का उपयोग करके कैथेटर को इंट्राथेकल स्पेस में रखने के प्रयास भी असफल रहे। इंटरलामिनार चौड़ाई की संकीर्णता के कारण, कैथेटर संभवतः रोस्ट्रल लैमिना से टकराएगा और आगे बढ़ने में विफल रहेगा।
यहां, किशोर चूहे में एक काठ का पंचर के माध्यम से सफल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य समाधान वितरण प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग वायरल वैक्टर के लिए किया जा सकता है, और संभवतः कोशिकाओं, फार्मास्यूटिकल्स और अन्य चिकित्सीय के लिए भी।
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Protocol
इस अध्ययन को एमोरी यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था। वर्तमान अध्ययन में स्प्रेग-डॉली चूहों (28-30 दिन की आयु, लगभग 90-135 ग्राम, पुरुषों और महिलाओं की सीमा में द्रव्यमान) का उपयोग किया गया था।
1. वेक्टर की तैयारी
- प्रक्रिया की शुरुआत में बर्फ पर AAV9 वेक्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) को पिघलाएं।
- माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को टेबल-टॉप सेंट्रीफ्यूज में संक्षेप में वेक्टर युक्त करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी तरल ट्यूब के तल में हैं।
- धीरे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब झटका सुनिश्चित करने के लिए कि समाधान अच्छी तरह मिश्रित है.
2. वसूली पिंजरे की तैयारी
- एक इलेक्ट्रिक कंबल पर एक साफ पिंजरा रखें ( सामग्री की तालिकादेखें) ताकि पिंजरे का केवल आधा हिस्सा कंबल के संपर्क में हो।
- कंबल का तापमान ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
3. सर्जिकल प्लेटफॉर्म की तैयारी
- एक इज़ोटेर्मल पैड ( सामग्री की तालिकादेखें) को माइक्रोवेव या पानी के स्नान में 39 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें ताकि सामग्री तरल हो जाए।
- सर्जिकल प्लेटफॉर्म पर इज़ोटेर्मल पैड रखें और इसे एक साफ शोषक बेंच पैड के साथ कवर करें।
4. पशु तैयारी
- एक स्पष्ट बॉक्स में isoflurane के साथ चूहों anesthetize (संस्थागत रूप से अनुमोदित प्रोटोकॉल के बाद). 5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके एनेस्थीसिया इंडक्शन शुरू करें, और 2% तक पहुंचने तक 1% प्रति मिनट नीचे कदम रखें। एक अतिरिक्त 3 मिनट के लिए 2% पर पशु पकड़ो.
- एक धूआं हुड के लिए जानवर पकड़े बॉक्स ले जाएँ और बॉक्स खुला.
नोट: यह संवेदनाहारी के लिए सर्जन के जोखिम को सीमित करता है। - बिजली के बाल कतरनी का उपयोग कर जानवर के पीछे से बाल निकालें.
नोट: वैकल्पिक रूप से, एक डिपिलिटरी क्रीम या मैनुअल रेजर और शेविंग क्रीम का उपयोग किया जा सकता है। - संज्ञाहरण नाक शंकु में अपने थूथन के साथ शल्य मंच पर पशु रखें.
नोट: जानवर चेतना हासिल करने के लिए शुरू हो सकता है, जबकि फर शल्य साइट से हटा दिया जाता है. यदि ऐसा होता है, तो ऊपर वर्णित अनुसार इसे फिर से एनेस्थेटाइज करें। - प्रक्रिया के दौरान कॉर्निया के सूखने को रोकने के लिए प्रत्येक आंख पर चिकनाई आंख मरहम लागू करें।
- पोविडोन-आयोडीन और आइसोप्रोपेनॉल वाइप्स के तीन वैकल्पिक अनुप्रयोगों का उपयोग करके सर्जिकल क्षेत्र कीटाणुरहित करें।
- एनाल्जेसिक (ओं) को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
नोट: ब्यूप्रेनोर्फिन का उपयोग आमतौर पर 0.01-0.05 मिलीग्राम/किग्रा की खुराक पर किया जाता है, जिसे हर 12 घंटे में दिया जाता है। वैकल्पिक रूप से, इस दवा का धीमी गति से जारी रूप 72 घंटे के लिए पर्याप्त दर्द नियंत्रण प्रदान करने के लिए 1 मिलीग्राम / किग्रा पर एक बार दिया जा सकता है। दर्द प्रबंधन के संबंध में उनके दिशानिर्देशों के लिए संस्थान के IACUC से परामर्श करें। - स्थानीय संज्ञाहरण प्रदान करने के लिए L2 से L6 स्पिनस प्रक्रियाओं के ऊपर चमड़े के नीचे 1% लिडोकेन के 100 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
- जानवर के नीचे कागज तौलिया या व्यास में 1.5 सेमी की एक ट्यूब का एक रोल रखें, बस कूल्हों के लिए रोस्ट्रल। यह रीढ़ को फ्लेक्स करने में मदद करता है, जिससे दो लैमिना के बीच सुई डालना आसान हो जाता है।
- जानवर पर एक फेनेस्टेड ड्रेप ( सामग्री की तालिकादेखें) रखें, काठ का रीढ़ पर फेनस्ट्रेशन को केंद्रित करें।
5. काठ का रीढ़ उजागर करना
- जानवर के पंजे में से प्रत्येक चुटकी और एक वापसी प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति के लिए देख द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें.
- एक # 11 स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, L2 से L6 के लिए midline नीचे त्वचा में लगभग 3 सेमी लंबा की एक चीरा बनाएँ.
- मांसपेशियों और त्वचा के बीच सर्जिकल कैंची की एक बाँझ घुमावदार जोड़ी डालने और फिर युक्तियों को खोलकर मांसपेशियों से त्वचा को ढीला करें।
- L2-L5 स्पिनस प्रक्रियाओं को कवर करने वाले प्रावरणी को हटा दें।
6. सिरिंज का लोड हो रहा है
- एक बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब की टोपी में वेक्टर (वांछित खुराक प्राप्त करने के लिए) के पिपेट 25-35 माइक्रोन।
- इंसुलिन सिरिंज में पूरी मात्रा ड्रा.
नोट: ध्यान रखें कि इस प्रक्रिया के दौरान हवा न खींचे।
7. इंजेक्शन लगाना
- L5 और L4 स्पिनस प्रक्रियाओं की पहचान करें।
नोट: L6 दो iliac शिखा के बीच सीधे बैठता है, और इसकी spinous प्रक्रिया एक कुंद साधन के साथ जांच करके की पहचान करने के लिए आसान होना चाहिए. फिर उपकरण को L5 और L4 प्रक्रियाओं की सीमाओं को खोजने के लिए धीरे से पीछे की ओर चलाया जा सकता है। - एक हाथ रखें ताकि अंगूठा जानवर की पूंछ और एक पैर पर धीरे से टिका रहे। सिरिंज को स्थिर करने के लिए एक उंगली का प्रयोग करें।
- सिरिंज की सुई की स्थिति इतना है कि यह L5 spinous प्रक्रिया के बाईं ओर है और अपने दुम अंत के साथ पंक्तिबद्ध. सिरिंज की स्थिति इतनी है कि यह मिडलाइन से लगभग 30 डिग्री और टेबल के विमान से 30 डिग्री ऊपर है।
नोट: यह बेहतर स्थलों की पहचान करने और सुई की नोक की स्थिति के लिए एक शल्य चिकित्सा माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए सहायक हो सकता है. - सिरिंज सुई आगे के बारे में 8 मिमी, L5 लामिना के शीर्ष पर और फिर काठ का कुंड में L4 लामिना के नीचे अग्रिम जब तक हड्डी मारा जाता है. सही प्लेसमेंट के परिणामस्वरूप पैर और/या पूंछ की एक चिकोटी होगी जिसे पैर/पूंछ पर आराम करने वाले अंगूठे द्वारा देखा या महसूस किया जा सकता है। यदि कोई चिकोटी नहीं है, तो सुई को हटा दें और बाईं ओर से प्रक्रिया का प्रयास करें। यदि अभी भी कोई चिकोटी नहीं है, तो आवश्यकतानुसार L4/L3 और L3/L2 के बीच की प्रक्रिया को दोहराएं।
- लगभग 5 सेकंड के लिए प्लंजर को धीरे-धीरे दबाएं।
नोट: इंजेक्शन के दौरान पैर या पूंछ में एक चिकोटी हो सकती है। - पूरी तरह से सवार को दबाने के बाद लगभग 30 एस के लिए जगह में सिरिंज पकड़ो दबाव संतुलन और इंजेक्शन के भाटा को कम करने के लिए अनुमति देने के लिए जब सुई वापस ले लिया जाता है.
- धीरे-धीरे सुई को हटा दें।
8. चीरा बंद करना
- चीरा के किनारों को अनुमानित करें।
- घाव के एक छोर पर शुरू, चीरा बंद करने के लिए एक 4-0 सिवनी ( सामग्री की तालिकादेखें) या सर्जिकल स्टेपल का उपयोग करें।
9. वसूली और निगरानी
- पहले से गरम पिंजरे में पशु रखें.
- कम से कम हर 15 मिनट पशु की जाँच करें जब तक यह पूरी तरह से चल है.
नोट: यह 15 मिनट और 45 मिनट के बीच लेना चाहिए। - अगले तीन दिनों के लिए, कम से कम दैनिक स्वास्थ्य जांच करें। सर्जरी के बाद पहले 2 दिनों के लिए या IACUC द्वारा आवश्यकतानुसार एनाल्जेसिक प्रदान करें।
- सर्जरी के एक सप्ताह बाद, टांके या स्टेपल हटा दें।
10. अनुवर्ती प्रक्रिया
नोट: इंजेक्शन तकनीक की सटीकता निर्धारित करने के लिए, ऊपर वर्णित के रूप में ट्रिपैन ब्लू डाई इंजेक्ट करें और फिर तुरंत जानवर को इच्छामृत्यु दें (संस्थागत रूप से अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन करें) और परिणाम की कल्पना करने के लिए लैमिनेक्टॉमी करें।
- जबकि जानवर संज्ञाहरण के तहत रहता है, 150 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से पेंटोबार्बिटल की घातक खुराक का प्रशासन करके इसे इच्छामृत्यु दें।
- एक बार जब श्वसन और हृदय गतिविधि बंद हो जाती है, तो मृत्यु सुनिश्चित करने के लिए छाती गुहा खोलें। सर्जिकल चीरा को गर्दन तक पीछे बढ़ाएं।
- स्पिनस प्रक्रियाओं के दोनों किनारों पर रीढ़ के समानांतर मांसपेशियों में 4 सेमी लंबा चीरा लगाएं, प्रक्रियाओं के जितना संभव हो उतना करीब रखें।
- ठीक संदंश या कैंची का प्रयोग, spinous प्रक्रियाओं के बीच में से मांसपेशियों को हटा दें.
- L6 से निचले वक्षीय रीढ़ तक स्पिनस प्रक्रियाओं को एक रोंगेउर का उपयोग करके निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें)। घुमा गति से बचें, क्योंकि इससे रोंगियर्स को नुकसान हो सकता है।
- L5 लैमिना के नीचे रोंगेउर की निचली नोक डालें और उसमें से कई "काटने" लेकर रीढ़ की हड्डी के ऊपर की हड्डी को हटा दें।
नोट: L6 स्पिनस प्रक्रिया पर वापस खींचने से रोंगेर की नोक डालना आसान हो सकता है। रीढ़ की हड्डी को नुकसान से बचाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। - लैमिनेक्टॉमी का विस्तार कम से कम चार लैमिना रोस्ट्रली जारी रखें। डाई के संकेतों के लिए लैमिना की आंतरिक सतह का निरीक्षण करें, जो एक असफल इंजेक्शन का संकेत दे सकता है।
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Representative Results
इंजेक्शन तकनीक की सटीकता निर्धारित करने के लिए, एक डाई, ट्रिपैन ब्लू, चिकित्सीय के लिए सरोगेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था। यह डाई आसानी से प्रोटीन से बांधती है, इसलिए यह आम तौर पर उस संरचना के भीतर रहती है जिसमें इसे इंजेक्ट किया गया था। इसका मतलब है कि डाई चिकित्सीय के इंजेक्शन के बाद के वितरण की सटीक भविष्यवाणी नहीं कर सकती है; इसका उपयोग केवल इंजेक्शन की सटीकता को प्रकट करने के लिए किया जाता है। जब सफलतापूर्वक काठ का कुंड में पेश किया जाता है, तो ट्रिपैन ब्लू ड्यूरा मेटर से बांधता है, रीढ़ की हड्डी की परिधि को नीला कर देता है। हालांकि, जब सुई ड्यूरा मेटर में प्रवेश करने में विफल रहती है, तो डाई एपिड्यूरल स्पेस में समाप्त हो जाती है। ड्यूरा मेटर और आसपास के ऊतकों (हड्डी की सतह और स्नायुबंधन और लैमिना को जोड़ने वाली मांसपेशियों) दोनों को नीले रंग का दाग दिया जाएगा। ये पैटर्न नग्न आंखों को आसानी से दिखाई देते हैं।
सही ढंग से और गलत तरीके से प्रशासित इंजेक्शन के बीच का अंतर यह आकलन करना मुश्किल है कि क्या कोई रीढ़ की हड्डी और रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के माध्यम से अनुप्रस्थ कटौती करता है। इसके बजाय, L5 लैमिना से शुरू होने वाले रॉंगर्स की एक जोड़ी का उपयोग करके लैमिनेक्टॉमी करने और रोस्टली को स्थानांतरित करने की सिफारिश की जाती है। इस प्रक्रिया में ड्यूरा मेटर को नुकसान न पहुंचाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग इस प्रक्रिया को आसान बनाता है. चित्रा 1 सफल इंजेक्शन और केवल आंशिक रूप से सफल इंजेक्शन के तुलनात्मक उदाहरण प्रदान करता है। एक सफल इंजेक्शन के साथ, सुई ट्रैक के साथ कोई भाटा नहीं देखा जाता है जब सुई वापस ले ली जाती है। एक सफल इंजेक्शन के बाद, रीढ़ की हड्डी को बेनकाब करने के लिए लैमिना को हटाने से रीढ़ की हड्डी के भीतर ट्रिपैन ब्लू का पता चलता है लेकिन हड्डी की सतह पर नहीं (चित्र 1ए)। डाई भी एक सफल इंजेक्शन (चित्रा 1 बी) के बाद मस्तिष्क तंत्र और सेरिबैलम पर दिखाई दे रहा है। इसके विपरीत, आंशिक रूप से सफल इंजेक्शन इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान सुई पथ को डाई के महत्वपूर्ण भाटा और/या हड्डी पर डाई के दृश्यमान सबूत(चित्रा 1सी)द्वारा प्रमाणित किया जाता है।
उपरोक्त प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करने वाले एएवी 9 वेक्टर के 28 माइक्रोन को 8.4 x 1013 वेक्टर जीनोम/एमएल की कुल खुराक के लिए 8.4 x 1011 वेक्टर जीनोम/एमएल की एकाग्रता में इंजेक्ट किया गया था। चार हफ्ते बाद, जानवरों को इच्छामृत्यु और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड10 के साथ छिद्रित किया गया। मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को तब काटा गया और जमे हुए सेक्शनिंग के लिए तैयार किया गया। 40 माइक्रोन मोटी वर्गों प्राप्त की और GFP के लिए दाग थे. चित्रा 2 इस वेक्टर के साथ प्राप्त पारगमन पैटर्न के उदाहरण प्रदान करता है। पारगमन आम तौर पर रीढ़ की हड्डी में सबसे अधिक था, विशेष रूप से काठ का क्षेत्र (चित्रा 2 ए-सी) में, संभवतः इंजेक्शन साइट से इसकी निकटता के कारण। मस्तिष्क का पारगमन हासिल किया गया था (चित्रा 2 डी-एफ), लेकिन, जैसा कि अपेक्षित था, यह रीढ़ की हड्डी में जो देखा गया था उससे अधिक सीमित था।
वायरस का एक बहुत का उपयोग कर एक एकल, अनुभवी सर्जन द्वारा प्राप्त परिणामों की प्रजनन क्षमता का वर्णन करने के लिए, इस अध्ययन के लिए इंजेक्शन 15 चूहों में से प्रत्येक से सेरिबैलम और प्रांतस्था के दाग वर्गों चित्रा 3 और चित्रा 4 में क्रमशः प्रस्तुत कर रहे हैं. ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के सना हुआ वर्गों भी इन 15 चूहों (चित्रा 5) के 7 के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. बेशक, मस्तिष्क पारगमन की राशि अलग खुराक के साथ भी अधिक परिवर्तनशीलता दिखा सकते हैं, वेक्टर बहुत, और सर्जन10.
चित्रा 1: डाई के इंजेक्शन के बाद रीढ़ की हड्डी का एक्सपोजर। लैमिनेक्टोमी को ट्रिपैन ब्लू के इंजेक्शन के बाद किया गया था। (ए) रीढ़ की हड्डी को सही ढंग से प्रशासित इंजेक्शन में नीला रंग दिया जाता है, और लैमिनेक्टॉमी (तीर) के दौरान हटाई गई हड्डी पर कोई डाई नहीं देखी जाती है। (बी) डाई भी brainstem के आसपास मनाया जा सकता है. (सी) एक इंजेक्शन में जहां इंजेक्शन के दौरान महत्वपूर्ण भाटा था, कॉर्ड के भीतर कम डाई होती है, और डाई हड्डी (तीर) की सतह पर मौजूद होती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: एएवी 9-जीएफपी के इंट्राथेकल डिलीवरी के बाद हासिल किए गए पारगमन पैटर्न के उदाहरण। (ए) ग्रीवा, (बी) वक्ष, और (सी) काठ का रीढ़ की हड्डी के 40 माइक्रोन मोटी वर्गों को जीएफपी (काला दाग) के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रूप से दाग दिया गया था। सभी स्तरों पर ग्रे मैटर ट्रांसडक्शन के उच्च स्तर देखे गए। (डी) इसके विपरीत, मस्तिष्क समग्र पारगमन को प्रदर्शित करता है। बाएँ और दाएँ बक्से क्रमशः (E) और (F) में आवर्धित होते हैं। (ई) धुंधला के बहुमत सेरिबैलम में मनाया जाता है, मुख्य रूप से Purkinje न्यूरॉन्स (तीर) में. (एफ) न्यूरॉन्स (तीर) और एस्ट्रोसाइट्स (एरोहेड्स) सेरेब्रल कॉर्टेक्स के भीतर ट्रांसड्यूड किए जाते हैं। स्केल बार: (एसी) 325 माइक्रोन; (डी) 5 मिमी; और (ई, एफ) 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: सेरिबैलम में पारगमन की प्रजनन क्षमता। एक ही खुराक और वायरस के बहुत सारे का उपयोग करके एक ही सर्जन द्वारा इंजेक्ट किए गए 15 चूहों के सेरिबैलम में पारगमन की पुनरुत्पादकता। स्केल बार: 1 मिमी। छवियों में संख्याएं चूहे आईडी नंबर ('कूड़े') को इंगित करती हैं। व्यक्तिगत')। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: प्रांतस्था में पारगमन की प्रजनन क्षमता। एक ही खुराक और बहुत सारे वायरस का उपयोग करके एक ही सर्जन द्वारा इंजेक्ट किए गए 15 चूहों के प्रांतस्था में पारगमन की पुनरुत्पादनशीलता। स्केल बार: 500 माइक्रोन। छवियों में संख्याएं चूहे आईडी नंबर ('कूड़े') को इंगित करती हैं। व्यक्तिगत')। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में पारगमन की प्रजनन क्षमता। एक ही खुराक और बहुत सारे वायरस का उपयोग करके एक ही सर्जन द्वारा इंजेक्ट किए गए 7 चूहों की ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में पारगमन की पुनरुत्पादनशीलता। स्केल बार: 500 माइक्रोन। छवियों में संख्याएं चूहे आईडी नंबर ('कूड़े') को इंगित करती हैं। व्यक्तिगत')। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
विभिन्न प्रकार के रोग सीएनएस को प्रभावित करते हैं। वायरल वेक्टर के माध्यम से प्रासंगिक जीन की एक कार्यात्मक प्रतिलिपि प्रदान करना उन लोगों के लिए एक आकर्षक उपचार रणनीति है जो प्रकृति में पुनरावर्ती और मोनोजेनिक हैं, जैसे कि स्पाइनल पेशी शोष। हालांकि, रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) अंतःशिरा11 दिया जीन थेरेपी वैक्टर सबसे बाहर है. जो लोग बीबीबी को पार कर सकते हैं, जैसे एएवी 9, परिधीय पारगमन12 के कारण वेक्टर नुकसान को दूर करने के लिए उच्च खुराक में दिया जाना चाहिए। उम्र भी एक बाधा है। विभिन्न एएवी सीरोटाइप के लिए पर्यावरणीय जोखिम13 साल की उम्र के साथ बढ़ जाती है और अक्सर एंटीबॉडी के उत्पादन की ओर जाता है जो चिकित्सीय वैक्टर14 को बेअसर कर सकता है। इसलिए, सीएनएस विकारों के लिए जीन थेरेपी वैक्टर की अंतःशिरा डिलीवरी आमतौर पर शिशुओं तक सीमित होती है और जीवन में बाद में निदान किए गए रोगियों में इसका उपयोग नहीं किया जाता है।
पुराने रोगियों के लिए, सीएसएफ में प्रत्यक्ष वेक्टर इंजेक्शन सीएनएस में व्यापक पारगमन उपज कर सकते हैं, दोनों बीबीबी और preexisting विरोधी एएवी एंटीबॉडी15 को दरकिनार कर. चूंकि यह दृष्टिकोण लक्षित है, इसलिए कम वेक्टर खुराक का भी उपयोग किया जा सकता है। नैदानिक सेटिंग में दो प्राथमिक दृष्टिकोण हैं: (1) काठ का पंचर और (2) पार्श्व निलय में इंजेक्शन। उत्तरार्द्ध अधिक जोखिम वहन करता है, लेकिन आम तौर पर अधिक मस्तिष्क पारगमन प्रदान करता है। काठ का पंचर सुरक्षित है, लेकिन पारगमन रीढ़ की हड्डी की ओर तिरछा है। मस्तिष्क पारगमन Trendelenburg स्थिति में रोगी रखकर बढ़ाया जा सकता है, लेकिन इस पर डेटा16,17 मिश्रित कर रहे हैं. एक काठ का पंचर के माध्यम से सिस्टर्न मैग्ना तक पहुंचने के लिए कैथेटर का उपयोग क्लिनिक में एक बेहतर विकल्प प्रदान कर सकता है, लेकिन यहउपयोग 5 के प्रारंभिक चरण में है। क्लिनिक में पशु मॉडल में काम किए गए दृष्टिकोणों का अनुवाद करने के लिए अन्य चुनौतियां हो सकती हैं, जैसे सीएसएफ रिसाव18 के कारण वेक्टर हानि और पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया19 में विषाक्तता।
कृन्तकों में किए गए सीएनएस-निर्देशित उपचारों के अधिकांश अध्ययन नवजात शिशुओं या वयस्क जानवरों (>60 दिन की आयु) का उपयोग करते हैं। नवजात शिशुओं को एक छोटे शरीर के आकार का लाभ होता है, जो उच्च प्रभावी खुराक और एक अपरिपक्व प्रतिरक्षा प्रणाली की अनुमति देता है, चिकित्सीय के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जटिलताओं से बचता है। हालांकि, मस्तिष्क के विकास के संदर्भ में, एक नवजात माउस या चूहा मनुष्यों में भ्रूण के चरण का बेहतर प्रतिनिधित्व करता है। 5-10 वर्ष आयु सीमा में बच्चों के लिए इरादा चिकित्सा के लिए, किशोर चूहा (25-35 दिन पुराना) न्यूरोलॉजिकल विकास20 के मामले में एक बेहतर मॉडल है. चूंकि इंट्राथेकल इंजेक्शन के लिए एक विधि पहले किशोर चूहों के लिए वर्णित नहीं की गई थी, और वयस्क चूहों और चूहों के लिए स्थापित विधियां इस उम्र में चूहों में अप्रभावी साबित हुईं, ऊपर वर्णित दृष्टिकोण विकसित किया गया था। स्पष्ट होने के लिए, किशोर चूहे न केवल वयस्कों की तुलना में छोटे होते हैं, बल्कि ड्यूरा की लोच में भी भिन्न हो सकते हैं जो रीढ़ की हड्डी की रक्षा करता है, जिससे एक प्रक्रिया होती है जो एक किशोर में अप्रभावी वयस्क चूहे में इस परत को पंचर करने का काम करती है।
किशोर चूहों में इंट्राथेकल इंजेक्शन करने का तरीका सीखते समय, चिकित्सीय के लिए सरोगेट के रूप में डाई (जैसे ट्रिपैन ब्लू) का उपयोग करना आवश्यक है, और उपयोगकर्ता को चिकित्सीय के साथ अध्ययन शुरू करने से पहले प्रक्रिया को सफलतापूर्वक और प्रजनन करने की उनकी क्षमता में अत्यधिक आत्मविश्वास होना चाहिए। तकनीक में कुशल बनने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होगी कि सिरिंज कैसा महसूस करती है जब प्रक्षेपवक्र लक्ष्य बनाम ऑफ-टारगेट होता है। दो सामान्य त्रुटियां हैं। यदि दृष्टिकोण का कोण बहुत उथला है, तो सुई लैमिना में से एक के शीर्ष या रोस्ट्रल लैमिना के पीछे से टकराएगी। कोई चिकोटी नहीं होगी, और सुई की प्रगति की दूरी 8 मिमी से कुछ मिलीमीटर कम होगी। यदि दृष्टिकोण का कोण बहुत अधिक है, तो एक जोखिम है कि सुई दो लैमिना के बीच से गुजरेगी और पेट की गुहा में प्रवेश करेगी। जब ऐसा होता है, तो सुई 8 मिमी से बहुत आगे बढ़ जाएगी। यदि ऐसा होता है, तो सुई को हटा दें, रिपोजिशन करें और पुनः प्रयास करें। कुछ अवसरों पर ऐसा हुआ है, क्षणिक रूप से वापसी और रिपोजिशनिंग से पहले कुछ मिलीमीटर द्वारा पेट की गुहा में प्रवेश करने से जानवरों को कोई स्पष्ट स्थायी नुकसान नहीं हुआ है।
यह पाया गया है कि सुई की नियुक्ति के लिए एक शारीरिक प्रतिक्रिया का अवलोकन इस प्रक्रिया के साथ सफलता की एक उच्च दर के साथ प्रजनन क्षमता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. जब कोई प्रतिक्रिया नहीं हुई, तो इंजेक्शन की सफलता दर कम थी। हालांकि, कुछ मामलों में, एक जानवर को प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए कई साइटों पर प्रयासों की आवश्यकता होती है, और डाई की मात्रा का पता लगाने के लिए पिछले सुई पटरियों में से एक या अधिक में मनाया गया था। एपिड्यूरल स्पेस में कोई डाई नहीं देखी गई थी, यह सुझाव देते हुए कि पिछली सुई की छड़ें पूंछ या पैर की चिकोटी पैदा किए बिना ड्यूरा में घुस गई थीं। चूंकि भाटा न्यूनतम था (इंजेक्शन से सुई ट्रैक में जो देखा जाता है उसके समान), यह माना जाता है कि इन उदाहरणों में वितरण प्रभावकारिता पर पिछली सुई की छड़ें का प्रभाव नगण्य था।
एक बार जब कोई प्रसव तकनीक में दक्षता प्राप्त कर लेता है, तो एक दूसरी, गैर-सर्जिकल चुनौती का सामना करना पड़ सकता है। विशेष रूप से, वयस्क चूहों (~ 70 दिनों की आयु) में, रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क में इंट्राथेकल डिलीवरी के लिए एएवी 9 वैक्टर की शक्ति बहुत से बहुत भिन्न हो सकती है, भले ही वे एक ही वेक्टर कोर द्वारा उत्पन्न हों। कुछ बैच उम्मीद के मुताबिक प्रदर्शन करेंगे, इसकी लंबाई के साथ रीढ़ की हड्डी ग्रे पदार्थ में पारगमन की उपज। अन्य, हालांकि, ग्रे पदार्थ घुसना करने में विफल हो जाएगा, मुख्य रूप से पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया10 पारगम. इस परिवर्तनशीलता का कारण स्पष्ट नहीं है, क्योंकि वैक्टर इन विट्रो में शक्तिशाली होते हैं और जब सीधे रीढ़ की हड्डी में इंजेक्ट किए जाते हैं। यह अनुशंसा की जाती है कि वायरस के किसी भी नए बैच के साथ 3-4 जानवरों का एक पायलट अध्ययन किया जाए ताकि यह पुष्टि की जा सके कि नया लॉट एक बड़ा अध्ययन शुरू करने से पहले अपेक्षित प्रदर्शन करता है। प्रोटीन ट्रांसजीन उत्पाद के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला या मात्रात्मक पीसीआर या डीडीपीसीआर21 का उपयोग करके ट्रांसजीन एमआरएनए या वेक्टर जीनोम की मात्रा निर्धारित करके शक्ति का मूल्यांकन किया जा सकता है। वायरल लॉट को अलग करने वाले अज्ञात चर के अलावा, पशु आयु, इंजेक्शन मात्रा, वितरण की गति और वेक्टर एकाग्रता में छोटे अंतर परिणामों में परिवर्तनशीलता का कारण बन सकते हैं। एक बड़ा अध्ययन शुरू करने से पहले, उन्हें प्रत्येक वायरस या अन्य उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंट के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
एक बार प्रशिक्षित होने के बाद, एक अनुभवी सर्जन लगभग 30 मिनट के भीतर एक किशोर चूहे की इंट्राथेकल इंजेक्शन प्रक्रिया को पूरा कर सकता है, संज्ञाहरण प्रेरण से वसूली अवधि की शुरुआत तक। यह बड़े समूहों को कम समय में इलाज करने की अनुमति देता है। सर्जरी से रिकवरी भी तेजी से होती है। अधिकांश जानवर सामान्य रूप से 20-30 मिनट के भीतर एम्बुलेट करते हैं। इन सर्जरी के 200 से अधिक प्रदर्शन करने के बाद, इस प्रक्रिया से कोई प्रतिकूल प्रभाव का सामना नहीं करना पड़ा है।
अंत में, पशु संकट को कम करना और सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान पशु कल्याण सुनिश्चित करना सर्वोपरि विचार हैं। इस प्रकार, एनेस्थेटिक्स और एनाल्जेसिक के उचित उपयोग की आवश्यकता होती है, और प्रक्रिया के दौरान शरीर का तापमान बनाए रखा जाना चाहिए और जब तक कि जानवर पूरी तरह से संज्ञाहरण से ठीक नहीं हो जाता। विभिन्न संस्थानों में संबंधित नियामक निकायों और पशु चिकित्सा कर्मचारियों की इन विषयों के बारे में अलग-अलग आवश्यकताएं और सिफारिशें हो सकती हैं। इस प्रक्रिया में वर्णित एनेस्थेटिक्स और एनाल्जेसिक का उपयोग एमोरी विश्वविद्यालय के पशु चिकित्सकों और IACUC कर्मचारियों के परामर्श से विकसित किया गया था। शोधकर्ताओं को आवश्यक लक्ष्यों को पूरा करने के लिए अपने स्थानीय पशु चिकित्सकों और IACUC के साथ मिलकर काम करना चाहिए।
इस प्रक्रिया की कुछ सीमाएँ हैं। यहां वर्णित विधि किशोर चूहों में उपयोग के लिए विकसित की गई थी, और मनुष्यों और चूहों के बीच असंख्य संरचनात्मक और अन्य अंतर इन प्रक्रियाओं के अनुवाद को मनुष्यों तक सीमित कर सकते हैं। किशोर चूहों में एक चिकित्सीय के काठ का इंट्राथेकल इंजेक्शन को सक्षम करने का बिंदु उम्मीदवार चिकित्सीय उपचार की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किशोर चूहा मॉडल के उपयोग को सुविधाजनक बनाना है - भले ही रोगियों में आवेदन के लिए प्रसव के सटीक मोड को बदलने की आवश्यकता हो।
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Disclosures
डॉन्सांटे एएवी 9 वैक्टर के सीएसएफ प्रशासन के संबंध में लंबित पेटेंट पर एक आविष्कारक हैं।
Acknowledgments
लेखक इंट्राथेकल इंजेक्शन के लिए किशोर चूहों द्वारा उत्पन्न चुनौती की उत्पादक चर्चा के लिए यूटी साउथवेस्टर्न के स्टीवन ग्रे, मैथ्यू रिओक्स, नंदा रेग्मी और लेसी स्टीयरमैन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम को आंशिक रूप से जगुआर जीन थेरेपी (जेएलएफके को) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
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