Summary
Ett kirurgiskt ingrepp beskrivs för att utföra injektioner i ländryggscisternen hos den unga råttan. Detta tillvägagångssätt har använts för intratekal leverans av genterapivektorer, men det förväntas att detta tillvägagångssätt kan användas för en mängd olika terapier, inklusive celler och läkemedel.
Abstract
Genterapi är en kraftfull teknik för att leverera nya gener till en patient för behandling av sjukdom, vare sig det är för att introducera en funktionell gen, inaktivera en toxisk gen eller tillhandahålla en gen vars produkt kan modulera sjukdomens biologi. Leveransmetoden för den terapeutiska vektorn kan ta många former, allt från intravenös infusion för systemisk tillförsel till direkt injektion i målvävnaden. För neurodegenerativa sjukdomar är det ofta önskvärt att snedvrida transduktionen mot hjärnan och/eller ryggmärgen. Det minst invasiva tillvägagångssättet för att rikta in sig på hela det centrala nervsystemet innebär injektion i cerebrospinalvätskan (CSF), vilket gör att läkemedlet kan nå en stor del av det centrala nervsystemet. Det säkraste sättet att leverera en vektor till ryggmärgsvätskan är den intratekala injektionen i ländryggen, där en nål förs in i ryggmärgens ländryggscistern. Denna teknik, även känd som en lumbalpunktion, har använts i stor utsträckning hos neonatala och vuxna gnagare och i stora djurmodeller. Även om tekniken är likartad mellan arter och utvecklingsstadier, kräver subtila skillnader i storlek, struktur och elasticitet hos vävnader som omger det intratekala utrymmet anpassningar i tillvägagångssättet. Den här artikeln beskriver en metod för att utföra lumbalpunktion på unga råttor för att leverera en adenoassocierad serotyp 9-vektor. Här injicerades 25-35 μL vektor i ländryggscisternen, och en grön fluorescerande proteinrapportör (GFP) användes för att utvärdera transduktionsprofilen som blev resultatet av varje injektion. Fördelarna och utmaningarna med detta tillvägagångssätt diskuteras.
Introduction
Löftet om viralmedierade genterapier har äntligen realiserats under de senaste åren med FDA:s godkännande av behandlingar för spinal muskelatrofi, retinal dystrofi, faktor IX-hemofili, cancer och mer 1,2,3,4. Oräkneliga andra terapier är för närvarande under utveckling. Genterapi syftar till att leverera en terapeutisk gen till en patients celler. Produkterna av denna nya gen kan ersätta den saknade aktiviteten från en bristfällig endogen gen, hämma en toxisk gen, döda cancerceller eller ge någon annan fördelaktig funktion.
För sjukdomar som påverkar det centrala nervsystemet (CNS) är det ofta önskvärt att leverera genterapivektorn direkt till målvävnaden. Icke-systemiska tillvägagångssätt ger två fördelar: de minimerar biverkningar utanför målet som kan orsakas av perifer transduktion, och de minskar kraftigt mängden vektor som behövs för att uppnå tillräckliga nivåer av transduktion i målvävnaden5.
Det finns en mängd olika metoder för att leverera genterapivektorer till CNS. Intraparenkymal injektion, injektion av en vektor direkt i ryggmärgen eller hjärnvävnaden, kan användas för leverans till ett definierat område. För många sjukdomar är dock en bred transduktion av CNS önskvärd. Detta kan åstadkommas genom att leverera en vektor till cerebrospinalvätskan (CSF)5, den vätska som flödar i och runt hjärnan och ryggmärgen. Det finns tre huvudsakliga sätt att leverera vektorer till CSF. Det mest invasiva tillvägagångssättet är intracerebroventrikulär tillförsel, vilket innebär att man borrar ett borrhål genom skallen och för fram en nål genom hjärnan in i de laterala ventriklarna. Detta ger transduktion i hela hjärnan. Ingreppet kan dock orsaka intrakraniell blödning, och metoden ger i allmänhet endast begränsad transduktion av ryggmärgen6. Injektion i cisterna magna vid skallbasen är mindre invasiv, men medför risk för skador på hjärnstammen. Även om det ofta används i djurförsök5, används injektion i cisterna magna inte längre rutinmässigt på kliniken7. Ländryggspunktion är den minst invasiva metoden för att komma åt CSF. Detta innebär att man placerar en nål mellan två ländkotor och in i ländryggen.
Ländryggspunktion för vektortillförsel utförs rutinmässigt på vuxna råttor och möss och på neonatala möss 8,9. Författarna till denna studie utförde nyligen lumbalpunktioner på unga råttor (28-30 dagar gamla) för att leverera adenoassocierade virus serotyp 9 (AAV9) vektorer. Hos vuxna råttor placerades en neonatal lumbalpunktionsnål vertikalt mellan L3- och L4-kotorna9. Korrekt placering resulterar i en svansknyck och CSF som rinner upp i nålbehållaren. Hos unga råttor kunde dock ingen av dessa avläsningar uppnås. Författarna försökte sedan anpassa en procedur för vuxna möss med hjälp av en 27 G insulinspruta som sattes in i en vinkel mellan L5 och L610. Hos vuxna möss, som vanligtvis är mindre än P28-råttor, ger detta inte en svansknyck, men felaktig nålplacering är uppenbar genom återflödet av injektatet. Hos unga råttor ledde dock detta tillvägagångssätt enhetligt till att injektatet levererades epiduralt, sannolikt på grund av olika elasticitet mellan vuxna möss och unga råttor i vävnadslagren som omger ryggmärgen. Katetermetoder utvärderades härnäst. Specifikt infördes en kateter genom ett snitt i dura i ländryggscisternen och upp till mitten av bröstkorgens ryggmärg; Detta tillvägagångssätt ledde dock till ett betydande återflöde av injektatet tillbaka ut ur snittstället under förlossningen. Försök att placera katetern perkutant i det intratekala utrymmet med hjälp av en styrkanyl misslyckades också. På grund av den smala bredden mellan laminärerna skulle katetern sannolikt träffa rostrallamina och misslyckas med att gå framåt.
Här beskrivs en metod för att uppnå framgångsrik och reproducerbar lösningsleverans via en lumbalpunktion hos den juvenila råttan. Detta tillvägagångssätt kan användas för virala vektorer, och sannolikt även för celler, läkemedel och andra terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Sprague-Dawley-råttor (28-30 dagar gamla, massa i intervallet 90-135 g, hanar och honor) användes i den aktuella studien.
1. Förberedelse av vektorn
- Tina AAV9-vektorn (se materialtabell) på is i början av proceduren.
- Centrifugera mikrocentrifugröret som innehåller vektorn kort i en bordscentrifug för att säkerställa att all vätska finns i botten av röret.
- Snärta försiktigt på mikrocentrifugröret för att säkerställa att lösningen är väl blandad.
2. Förberedelse av återhämtningsburen
- Placera en ren bur på en elektrisk filt (se materialtabell) så att endast halva buren är i kontakt med filten.
- Ställ in temperaturen på filten till ~37 °C.
3. Förberedelse av den kirurgiska plattformen
- Värm en isotermisk dyna (se materialtabell) till 39 °C i mikrovågsugn eller vattenbad så att innehållet blir flytande.
- Placera den isotermiska dynan på den kirurgiska plattformen och täck den med en ren absorberande bänkdyna.
4. Förberedelse av djur
- Bedöva råttorna med isofluran i en genomskinlig låda (enligt institutionellt godkända protokoll). Börja anestesiinduktionen med 5 % isofluran och trappa ner 1 % per minut tills du når 2 %. Håll djuret på 2 % i ytterligare 3 minuter.
- Flytta lådan som håller djuret till ett dragskåp och öppna lådan.
OBS: Detta begränsar kirurgens exponering för bedövningsmedlet. - Ta bort håret från djurets rygg med hjälp av en elektrisk hårklippare.
OBS: Alternativt kan en hårborttagningskräm eller manuell rakhyvel och rakkräm användas. - Placera djuret på den kirurgiska plattformen med nosen i anestesinäskonen.
OBS: Djuret kan börja återfå medvetandet medan pälsen tas bort från operationsområdet. Om detta händer, bedöva det igen enligt beskrivningen ovan. - Applicera smörjande ögonsalva på varje öga för att förhindra uttorkning av hornhinnorna under ingreppet.
- Desinficera det kirurgiska området med tre alternerande appliceringar av povidon-jod- och isopropanolservetter.
- Injicera smärtstillande medel subkutant.
OBS: Buprenorfin ges i allmänhet i en dos på 0,01-0,05 mg/kg, givet var 12:e timme. Alternativt kan en långsam frisättning av detta läkemedel ges en gång med 1 mg/kg för att ge tillräcklig smärtkontroll i 72 timmar. Rådgör med institutionens IACUC för deras riktlinjer för smärtbehandling. - Injicera 100 μL 1 % lidokain subkutant ovanför L2 till L6 spinösa utskott för att ge lokalbedövning.
- Placera en rulle hushållspapper eller ett rör med en diameter på 1,5 cm under djuret, precis vid höfterna. Detta hjälper till att böja ryggraden, vilket gör det lättare att föra in nålen mellan de två lamellerna.
- Placera ett fenestrerat fall (se Materialtabell) på djuret och centrera fenestreringen över ländryggen.
5. Exponera ländryggen
- Bekräfta anestesidjupet genom att nypa var och en av djurets tassar och leta efter frånvaron av en abstinensreaktion.
- Använd ett #11 skalpellblad för att skapa ett snitt som är cirka 3 cm långt i huden längs mittlinjen från L2 till L6.
- Lossa huden från muskeln genom att föra in en steril böjd kirurgisk sax mellan muskeln och huden och sedan öppna spetsarna.
- Ta bort fascian som täcker L2-L5 ryggradsutskotten.
6. Laddning av sprutan
- Pipettera 25-35 μL av vektorn (för att uppnå önskad dos) i locket på ett sterilt mikrocentrifugrör.
- Dra upp hela volymen i insulinsprutan.
OBS: Var noga med att inte dra upp luft under denna process.
7. Utföra injektionen
- Identifiera L5 och L4 spinous processer.
OBS: L6 sitter direkt mellan de två höftbenskammarna, och dess spinösa utskott bör vara lätt att identifiera genom att sondera med ett trubbigt instrument. Instrumentet kan sedan försiktigt köras upp på baksidan för att hitta gränserna för L5- och L4-processerna. - Placera en hand så att tummen vilar mjukt på djurets svans och ett ben. Använd ett finger för att stabilisera sprutan.
- Placera nålen på sprutan så att den är till vänster om L5-spinös process och i linje med dess kaudala ände. Placera sprutan så att den är ungefär 30° från mittlinjen och 30° upp från bordsplanet.
OBS: Det kan vara bra att använda ett kirurgiskt mikroskop för att bättre identifiera landmärken och placera nålspetsen. - För fram sprutkanylen ca 8 mm, över toppen av L5-lamina och sedan under L4-lamina in i ländryggscisternen tills benet träffas. Korrekt placering kommer att resultera i en ryckning i benet och/eller svansen som kan ses eller kännas av tummen som vilar på benet/svansen. Om det inte finns någon ryckning, ta bort nålen och försök proceduren från vänster sida. Om det fortfarande inte finns några ryckningar, upprepa proceduren mellan L4/L3 och L3/L2 vid behov.
- Tryck långsamt in kolven i cirka 5 s.
OBS: Det kan förekomma ryckningar i benet eller svansen under injektionen. - Håll sprutan på plats i cirka 30 sekunder efter att du har tryckt ned kolven helt för att låta trycket komma i jämvikt och minimera återflödet av injektatet när nålen dras ut.
- Ta långsamt bort nålen.
8. Stängning av snittet
- Approximera kanterna på snittet.
- Börja i ena änden av såret, använd en 4-0 sutur (se Materialtabell) eller kirurgiska häftklamrar för att stänga snittet.
9. Återhämtning och övervakning
- Placera djuret i den förvärmda buren.
- Kontrollera djuret minst var 15:e minut tills det är helt rörligt.
OBS: Detta bör ta mellan 15 min och 45 min. - Under de kommande tre dagarna ska du utföra hälsokontroller minst en gång om dagen. Tillhandahåll smärtstillande medel under de första 2 dagarna efter operationen eller enligt IACUC:s krav.
- En vecka efter operationen tar du bort suturerna eller häftklamrarna.
10. Uppföljningsförfarande
OBS: För att bestämma noggrannheten i injektionstekniken, injicera trypan blue dye enligt beskrivningen ovan och avliva sedan omedelbart djuret (enligt institutionellt godkända protokoll) och utför en laminektomi för att visualisera resultatet.
- Medan djuret förblir under narkos avlivas det genom att administrera en dödlig dos pentobarbital via intraperitoneal injektion i en dos på 150 mg/kg.
- När andningen och hjärtaktiviteten upphör, öppna brösthålan för att säkerställa döden. Förläng det kirurgiska snittet upp i ryggen till nacken.
- Gör ett snitt 4 cm långt i muskeln parallellt med ryggraden på båda sidor av ryggradsutskotten, håll dig så nära utskotten som möjligt.
- Använd en fin pincett eller sax för att ta bort muskeln mellan ryggradsutskotten.
- Ta bort de spinösa utskotten från L6 upp till nedre delen av bröstryggen med hjälp av en rongeur (se Materialtabell). Undvik vridande rörelser, eftersom det kan skada rongeurs.
- Sätt in den nedre spetsen av rongeur under L5-lamina och ta bort benet som ligger över ryggmärgen genom att ta flera "bett" ur den.
OBS: Att dra tillbaka L6 spinous process kan göra det lättare att sätta in spetsen på rongeur. Försiktighet måste iakttas för att förhindra skador på ryggmärgen. - Fortsätt att expandera laminektomin minst fyra lameller rostralt. Inspektera den inre ytan av lamellerna för tecken på färgämne, vilket kan tyda på en misslyckad injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bestämma noggrannheten i injektionstekniken användes ett färgämne, trypanblått, som ett surrogat för den terapeutiska. Detta färgämne binder lätt till proteiner, så det stannar i allmänhet inom den struktur som det injicerades i. Detta innebär att färgämnet kanske inte exakt förutsäger fördelningen av läkemedlet efter injektionen. Det används helt enkelt för att avslöja noggrannheten i injektionen. När det framgångsrikt införs i ländryggscisternen binder trypanblått till dura mater och färgar ryggmärgens omkrets blå. Men när nålen inte lyckas tränga igenom dura mater hamnar färgämnet i epiduralrummet. Både dura mater och de omgivande vävnaderna (benets yta och ligamenten och musklerna som förbinder lamellerna) kommer att färgas blå. Dessa mönster är lätta att se för blotta ögat.
Skillnaden mellan korrekt och felaktigt utförd injektion är svår att bedöma om man bara gör ett tvärsnitt genom ryggmärgen och ryggraden. Istället rekommenderas att utföra en laminektomi med hjälp av ett par rongeurs som börjar vid L5-lamina och rör sig rostralt. Försiktighet måste iakttas så att dura mater inte skadas i processen. Att använda dissekeringsmikroskopet gör denna process enklare. Figur 1 ger jämförande exempel på lyckade injektioner och endast delvis lyckade injektioner. Vid en lyckad injektion observeras liten eller ingen reflux längs nålbanan när nålen dras ut. Efter en lyckad injektion avlägsnas lamellan för att exponera ryggmärgen och trypanblått i ryggmärgen avslöjas, men inte på benets yta (Figur 1A). Färgämnet är också synligt på hjärnstammen och lillhjärnan efter en lyckad injektion (Figur 1B). En delvis lyckad injektion visar sig däremot genom ett betydande återflöde av färgämne som backar upp i nålkanalen under injektionsprocessen och/eller synliga tecken på färgämne på benet (Figur 1C).
Med hjälp av ovanstående procedur injicerades 28 μl av en AAV9-vektor som uttrycker förstärkt grönt fluorescerande protein (GFP) i en koncentration av 3 x 1013 vektorgenom/ml, för en total dos på 8,4 x 1011 vektorgenom/djur. Fyra veckor senare avlivades djuren och perfunderades med 4 % paraformaldehyd10. Hjärnan och ryggmärgen skördades sedan och förbereddes för frysning av snitt. 40 μm tjocka sektioner erhölls och färgades för GFP. Figur 2 ger exempel på transduktionsmönstret som erhålls med denna vektor. Transduktionen var generellt högst i ryggmärgen, särskilt i ländryggen (Figur 2A-C), troligen på grund av dess närhet till injektionsstället. Omvandlingen av hjärnan uppnåddes (Figur 2D-F), men som förväntat tenderade den att vara mer begränsad än vad som sågs i ryggmärgen.
För att illustrera reproducerbarheten av resultat som uppnåtts av en enda, erfaren kirurg som använde ett enda parti virus, presenteras färgade delar av lillhjärnan och cortex från var och en av de 15 råttor som injicerats för denna studie i figur 3 respektive figur 4. De färgade delarna av den cervikala ryggmärgen presenteras också för 7 av dessa 15 råttor (Figur 5). Naturligtvis kan mängden hjärntransduktion visa ännu större variabilitet med olika doser, vektorpartier och kirurger10.
Figur 1: Exponering av ryggmärgen efter en injektion av färgämnet. Laminektomi utfördes efter injektion av trypanblått. (A) Ryggmärgen färgas blå vid en korrekt utförd injektion och inget färgämne ses på benet som avlägsnats under laminektomin (pilarna). (B) Färgämnet kan också observeras runt hjärnstammen. (C) Vid en injektion där det förekom betydande reflux under injektionen finns det mindre färgämne i strängen och färg finns på benets yta (pilar). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på transduktionsmönster uppnådda efter intratekal tillförsel av AAV9-GFP. 40 μm tjocka snitt av (A) livmoderhalsen, (B) bröstkorgen och (C) ländryggmärgen var immunhistokemiskt färgade för GFP (svart fläck). Höga nivåer av transduktion av grå substans observerades på alla nivåer. (D) Däremot uppvisar hjärnan en glesare total transduktion. De vänstra och högra rutorna förstoras i (E) respektive (F). (E) Huvuddelen av färgningen observeras i lillhjärnan, främst i Purkinje-neuroner (pilar). (F) Neuroner (pilar) och astrocyter (pilspetsar) transduceras i hjärnbarken. Skalstreck: (A-C) 325 μm; D) 5 mm. och (E,F) 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Reproducerbarhet av transduktion i lillhjärnan. Reproducerbarhet av transduktion i lillhjärnan hos 15 råttor injicerade av samma kirurg med samma dos och mycket av viruset. Skalstång: 1 mm. Siffrorna på bilderna anger råttornas ID-nummer ("kull". enskilda"). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Reproducerbarhet av transduktion i cortex. Reproducerbarhet av transduktion i cortex hos 15 råttor injicerade av samma kirurg med samma dos och mycket virus. Skalstång: 500 μm. Siffrorna på bilderna anger råttornas ID-nummer ("kull". enskilda"). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Reproducerbarhet av transduktion i den cervikala ryggmärgen. Reproducerbarhet av transduktion i den cervikala ryggmärgen hos 7 råttor injicerade av samma kirurg med samma dos och mycket virus. Skalstång: 500 μm. Siffrorna på bilderna anger råttornas ID-nummer ("kull". enskilda"). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En mängd olika sjukdomar påverkar CNS. Att tillhandahålla en funktionell kopia av den relevanta genen via en viral vektor är en attraktiv behandlingsstrategi för dem som är recessiva och monogena till sin natur, såsom spinal muskelatrofi. Blod-hjärnbarriären (BBB) utesluter dock de flesta genterapivektorer som ges intravenöst11. De som kan passera BBB, såsom AAV9, måste ges i höga doser för att övervinna vektorförlusten på grund av perifer transduktion12. Åldern är också ett hinder. Exponeringen för de olika AAV-serotyperna ökar vid13 års ålder och leder ofta till produktion av antikroppar som kan neutralisera terapeutiska vektorer14. Därför är intravenös tillförsel av genterapivektorer för CNS-sjukdomar i allmänhet begränsad till spädbarn och används inte till patienter som diagnostiseras senare i livet.
För äldre patienter kan direkt vektorinjektion i ryggmärgsvätskan ge en bred transduktion i CNS, förbi både BBB och redan existerande anti-AAV-antikroppar15. Eftersom detta tillvägagångssätt är målinriktat kan även lägre vektordoser användas. Det finns två huvudsakliga tillvägagångssätt i den kliniska miljön: (1) lumbalpunktion och (2) injektion i de laterala ventriklarna. Det senare medför större risk, men ger i allmänhet större hjärntransduktion. Ländryggspunktion är säkrare, men transduktionen är skev mot ryggmärgen. Hjärntransduktion kan förbättras genom att placera patienten i Trendelenburg-positionen, men data om detta är blandade16,17. Att använda en kateter för att nå cisterna magna via en lumbalpunktion kan vara ett bättre alternativ på kliniken, men det är i ett tidigt skedeav användning. Det kan finnas andra utmaningar med att översätta metoder som utarbetats i djurmodeller till kliniken, såsom vektorförlust på grund av läckage av cerebrospinalvätska18 och toxicitet i dorsalrotsganglierna19.
I de flesta studier av CNS-riktade behandlingar på gnagare används nyfödda eller vuxna djur (>60 dagars ålder). Nyfödda har fördelen av en liten kroppsstorlek, vilket möjliggör högre effektiva doser, och ett omoget immunförsvar, vilket undviker komplikationerna av ett immunsvar mot den terapeutiska. Men när det gäller hjärnans utveckling representerar en nyfödd mus eller råtta bättre ett fosterstadium hos människor. För terapier avsedda för barn i åldern 5-10 år är den juvenila råttan (25-35 dagar gammal) en bättre modell när det gäller neurologisk utveckling20. Eftersom en metod för intratekal injektion inte tidigare hade beskrivits för unga råttor, och metoder som etablerats för vuxna möss och råttor visade sig vara ineffektiva på råttor i denna ålder, utvecklades det ovan beskrivna tillvägagångssättet. För att vara tydlig är unga råttor inte bara mindre än vuxna utan kan också skilja sig åt i elasticiteten hos dura som skyddar ryggmärgen, vilket gör en procedur som fungerar för att punktera detta lager hos en vuxen råtta ineffektiv hos en juvenil.
När man lär sig hur man utför intratekal injektion på unga råttor, är det nödvändigt att använda ett färgämne (t.ex. trypanblått) som ett surrogat för den terapeutiska, och användaren bör vara mycket säker på sin förmåga att framgångsrikt och reproducerbart utföra proceduren innan en studie med en terapeutisk start startar. Att bli skicklig i tekniken kommer att kräva övning för att få erfarenhet av hur sprutan känns när banan är på målet kontra utanför målet. Det finns två vanliga fel. Om infallsvinkeln är för grund kommer nålen att träffa toppen av en av lamellerna eller baksidan av rostrala lamellerna. Det kommer inte att finnas några ryckningar, och avståndet som nålen går framåt kommer att vara några millimeter mindre än 8 mm. Om infallsvinkeln är för stor finns det risk för att nålen passerar mellan de två lamellerna och tränger in i bukhålan. När detta händer kommer nålen att gå mycket längre än 8 mm. Om detta händer, ta bort nålen, flytta om och försök igen. Vid de få tillfällen som detta har hänt har det inte orsakat någon uppenbar bestående skada för djuren att tillfälligt ha kommit in i bukhålan med några millimeter innan det dras tillbaka och ompositionerats.
Det har visat sig att det är avgörande att observera en fysisk reaktion på placeringen av nålen för att uppnå reproducerbarhet med en hög grad av framgång med denna procedur. När det inte fanns något svar var framgångsfrekvensen för injektionen låg. I vissa fall krävde dock ett djur försök på flera ställen för att uppnå ett svar, och spårmängder av färgämne observerades i ett eller flera av de tidigare nålspåren. Inget färgämne observerades i epiduralrummet, vilket tyder på att några av de tidigare nålsticken hade trängt in i dura utan att orsaka en ryckning i svansen eller benen. Eftersom refluxen var minimal (liknande vad som observerades i nålspåret från injektionen) tror man att effekten av tidigare nålstick på leveranseffekten i dessa fall var försumbar.
När man väl har uppnått skicklighet i förlossningstekniken kan man stöta på en andra, icke-kirurgisk utmaning. Specifikt, hos vuxna råttor (~70 dagars ålder), kan styrkan hos AAV9-vektorer för intratekal leverans till ryggmärgen och hjärnan variera avsevärt från parti till parti, även när de genereras av samma vektorkärna. Vissa batcher kommer att fungera som förväntat, vilket ger transduktion i ryggmärgens grå substans längs dess längd. Andra kommer dock att misslyckas med att tränga in i den grå substansen, främst genom att transducera dorsalrotsganglierna10. Orsaken till denna variabilitet är oklar, eftersom vektorerna är potenta in vitro och när de injiceras direkt i ryggmärgen. Det rekommenderas att en pilotstudie på 3–4 djur utförs på varje ny sats virus för att bekräfta att det nya partiet fungerar som förväntat innan en stor studie inleds. Potensen kan bedömas med hjälp av antingen immunhistokemisk färgning eller immunofluorescensfärgning av proteintransgenprodukten eller kvantifiering av mängden transgen mRNA eller vektorgenom med hjälp av kvantitativ PCR eller ddPCR21. Förutom de okända variablerna som skiljer viruspartier åt, kan små skillnader i djurens ålder, injektionsvolym, leveranshastighet och vektorkoncentration orsaka variationer i resultaten. Innan man påbörjar en stor studie kan de behöva optimeras för varje virus eller annat potentiellt terapeutiskt medel.
När den väl är utbildad kan en erfaren kirurg slutföra den intratekala injektionsproceduren för en ung råtta inom cirka 30 minuter, från anestesiinduktion till början av återhämtningsperioden. Detta gör det möjligt att behandla stora kohorter på kort tid. Återhämtningen efter operationen går också snabbt. De flesta djur ambulerar normalt inom 20-30 min. Efter att ha utfört mer än 200 av dessa operationer har inga negativa effekter från denna procedur uppstått.
Slutligen är det av största vikt att minimera djurens lidande och säkerställa djurens välbefinnande under kirurgiska ingrepp. Därför krävs korrekt användning av bedövningsmedel och smärtstillande medel, och kroppstemperaturen måste upprätthållas under ingreppet och tills djuret återhämtar sig helt från narkosen. De relevanta tillsynsorganen och veterinärpersonalen vid olika institutioner kan ha olika krav och rekommendationer angående dessa ämnen. Användningen av bedövningsmedel och smärtstillande medel som beskrivs i denna procedur har utvecklats i samråd med veterinärerna vid Emory University och IACUC-personalen. Forskare bör ha ett nära samarbete med sina lokala veterinärer och IACUC för att uppnå de nödvändiga målen.
Det finns vissa begränsningar i denna procedur. Metoden som beskrivs här utvecklades för användning på unga råttor, och otaliga strukturella och andra skillnader mellan människor och råttor kan begränsa översättningen av dessa procedurer till människor. Poängen med att möjliggöra intratekal injektion i ländryggen av en terapeutisk behandling på unga råttor är att underlätta användningen av modellen för juvenila råttor för att testa effektiviteten av den föreslagna terapeutiska behandlingen - även om det exakta leveranssättet skulle behöva ändras för tillämpning på patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Donsante är uppfinnare av ett pågående patent avseende administrering av AAV9-vektorer i cerebrospinalvätska.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi och Lacey Stearman från UT Southwestern för en produktiv diskussion om den utmaning som unga råttor utgör för intratekal injektion. Detta arbete stöddes delvis av finansiering från Jaguar Gene Therapy (till JLFK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A.
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
