Summary
Et kirurgisk indgreb er beskrevet for at udføre injektioner i lændecisternen hos den unge rotte. Denne tilgang er blevet brugt til intratekal levering af genterapivektorer, men det forventes, at denne tilgang kan bruges til en række forskellige terapier, herunder celler og lægemidler.
Abstract
Genterapi er en kraftfuld teknologi til at levere nye gener til en patient til behandling af sygdom, hvad enten det er at introducere et funktionelt gen, inaktivere et giftigt gen eller tilvejebringe et gen, hvis produkt kan modulere sygdommens biologi. Leveringsmetoden for den terapeutiske vektor kan antage mange former, lige fra intravenøs infusion til systemisk levering til direkte injektion i målvævet. Ved neurodegenerative lidelser er det ofte ønskeligt at skævvride transduktionen mod hjernen og/eller rygmarven. Den mindst invasive tilgang til at målrette mod hele centralnervesystemet involverer injektion i cerebrospinalvæsken (CSF), hvilket gør det muligt for terapien at nå en stor del af centralnervesystemet. Den sikreste tilgang til at levere en vektor ind i CSF er den lumbale intratekale injektion, hvor en nål indføres i rygmarvens lændecistern. Denne teknik, også kendt som en lumbalpunktur, er blevet meget brugt i neonatale og voksne gnavere og i store dyremodeller. Mens teknikken er ens på tværs af arter og udviklingsstadier, kræver subtile forskelle i størrelse, struktur og elasticitet af væv, der omgiver det intratekale rum, tilpasninger i tilgangen. Denne artikel beskriver en metode til at udføre lumbalpunktur hos unge rotter for at levere en adeno-associeret serotype 9-vektor. Her blev 25-35 μL vektor injiceret i lændecisternen, og en grøn fluorescerende protein (GFP) reporter blev brugt til at evaluere transduktionsprofilen som følge af hver injektion. Fordelene og udfordringerne ved denne tilgang diskuteres.
Introduction
Løftet om viralmedierede genterapier er endelig blevet realiseret i de senere år med FDA's godkendelse af behandlinger for spinal muskelatrofi, retinal dystrofi, faktor IX hæmofili, kræft og mere 1,2,3,4. Utallige andre behandlinger er i øjeblikket under udvikling. Genterapi har til formål at levere et terapeutisk gen til en patients celler. Produkterne af dette nye gen kan erstatte den manglende aktivitet fra et mangelfuldt endogent gen, hæmme et giftigt gen, dræbe kræftceller eller give en anden gavnlig funktion.
For sygdomme, der påvirker centralnervesystemet (CNS), er det ofte ønskeligt at levere genterapivektoren direkte til målvævet. Ikke-systemiske tilgange giver to fordele: de minimerer bivirkninger uden for målet, der kan være forårsaget af perifer transduktion, og de reducerer i høj grad mængden af vektor, der er nødvendig for at opnå tilstrækkelige transduktionsniveauer i målvævet5.
Der er en række forskellige tilgange til at levere genterapivektorer til CNS. Intraparenkymal injektion, injektion af en vektor direkte i rygmarven eller hjernevævet, kan bruges til levering til et defineret område. For mange sygdomme ønskes imidlertid bred transduktion af CNS. Dette kan opnås ved at levere en vektor til cerebrospinalvæsken (CSF)5, væsken, der strømmer i og omkring hjernen og rygmarven. Der er tre primære måder at levere vektorer til CSF på. Den mest invasive tilgang er intracerebroventrikulær levering, som involverer at bore et hul gennem kraniet og føre en nål gennem hjernen ind i de laterale ventrikler. Dette giver transduktion i hele hjernen. Indgrebet kan dog forårsage intrakraniel blødning, og tilgangen giver generelt kun begrænset transduktion af rygmarven6. Injektion i cisterna magna i bunden af kraniet er mindre invasiv, men medfører risiko for skade på hjernestammen. Mens det ofte bruges i dyreforsøg5, bruges injektion i cisterna magna ikke længere rutinemæssigt i klinikken7. Lumbalpunktur er den mindst invasive tilgang til at få adgang til CSF. Dette indebærer at placere en nål mellem to lændehvirvler og ind i lændecisternen.
Lumbalpunktur til vektorlevering udføres rutinemæssigt hos voksne rotter og mus og hos neonatale mus 8,9. Forfatterne af denne undersøgelse udførte for nylig lumbalpunkturer hos unge rotter (28-30 dages alderen) for at levere adeno-associerede virus serotype 9 (AAV9) vektorer. Hos voksne rotter blev en neonatal lumbalpunkturnål placeret lodret mellem L3- og L4-ryghvirvlerne9. Korrekt placering resulterer i et halesvirp og CSF, der strømmer op i nålebeholderen. Hos unge rotter kunne ingen af disse udlæsninger dog opnås. Forfatterne forsøgte derefter at tilpasse en voksen museprocedure ved hjælp af en 27 G insulinsprøjte indsat i en vinkel mellem L5 og L610. Hos voksne mus, som typisk er mindre end P28-rotter, giver dette ikke et haleslag, men forkert nåleplacering er tydelig ved tilbagestrømningen af injektatet. Hos unge rotter førte denne tilgang imidlertid ensartet til, at injiceret blev leveret epiduralt, sandsynligvis som følge af forskellig elasticitet mellem voksne mus og unge rotter i vævslagene omkring rygmarven. Katetertilgange blev derefter evalueret. Specifikt blev et kateter indført gennem et snit i lumbalcisternens dura og op til den midterste thorax rygmarv; Denne tilgang førte dog til betydelig tilbagesvaling af injiceret tilbage ud af snitstedet under fødslen. Forsøg på at placere kateteret i det intratekale rum perkutant ved hjælp af en guidenål var heller ikke forgæves. På grund af den smalle interlaminærbredde vil kateteret sandsynligvis ramme rostral lamina og ikke komme frem.
Her beskrives en metode til at opnå vellykket og reproducerbar opløsningslevering via en lumbalpunktur hos den unge rotte. Denne tilgang kan bruges til virale vektorer og sandsynligvis også til celler, lægemidler og andre terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Sprague-Dawley-rotter (28-30 dages alder, masse i intervallet omkring 90-135 g, hanner og hunner) blev brugt i denne undersøgelse.
1. Forberedelse af vektoren
- Optø AAV9-vektoren (se materialetabellen) på is i begyndelsen af proceduren.
- Centrifuger mikrocentrifugerøret, der indeholder vektoren, kortvarigt i en bordcentrifuge for at sikre, at al væsken er i bunden af røret.
- Svirp forsigtigt mikrocentrifugerøret for at sikre, at opløsningen er godt blandet.
2. Klargøring af bjærgningsburet
- Placer et rent bur på et elektrisk tæppe (se materialetabellen), så kun halvdelen af buret er i kontakt med tæppet.
- Indstil temperaturen på tæppet til ~37 °C.
3. Forberedelse af den kirurgiske platform
- Opvarm en isotermisk pude (se materialetabellen) til 39 °C i en mikrobølgeovn eller et vandbad, så indholdet bliver flydende.
- Placer den isotermiske pude på operationsplatformen og dæk den med en ren absorberende bænkpude.
4. Tilberedning af dyr
- Bedøve rotterne med isofluran i en gennemsigtig æske (efter institutionelt godkendte protokoller). Begynd anæstesiinduktionen med 5% isofluran, og nedtrapp 1% i minuttet, indtil du når 2%. Hold dyret på 2 % i yderligere 3 min.
- Flyt kassen, der holder dyret, til et stinkskab, og åbn kassen.
BEMÆRK VENLIGST: Dette begrænser kirurgens eksponering for bedøvelsesmidlet. - Fjern hårene fra ryggen af dyret ved hjælp af elektriske hårklippere.
BEMÆRK VENLIGST: Alternativt kan en hårfjerningscreme eller manuel barbermaskine og barbercreme bruges. - Placer dyret på operationsplatformen med snuden i anæstesinæsekeglen.
BEMÆRK: Dyret kan begynde at genvinde bevidstheden, mens pelsen fjernes fra operationsstedet. Hvis dette sker, skal du bedøve det igen som beskrevet ovenfor. - Påfør smørende øjensalve på hvert øje for at forhindre udtørring af hornhinderne under proceduren.
- Desinficer det kirurgiske område ved hjælp af tre skiftevis påføringer af povidon-jod- og isopropanolservietter.
- Injicer smertestillende middel(er) subkutant.
BEMÆRK: Buprenorphin anvendes generelt i en dosis på 0,01-0,05 mg/kg, givet hver 12. time. Alternativt kan en langsom frigivelsesform af dette lægemiddel gives én gang ved 1 mg/kg for at give tilstrækkelig smertekontrol i 72 timer. Rådfør dig med institutionens IACUC for deres retningslinjer vedrørende smertebehandling. - Injicer 100 μL 1% lidokain subkutant over L2 til L6 spinøse processer for at give lokalbedøvelse.
- Læg en rulle papirhåndklæde eller et rør på 1,5 cm i diameter under dyret, bare rostralt til hofterne. Dette hjælper med at bøje rygsøjlen, hvilket gør det lettere at stikke nålen ind mellem de to lameller.
- Placer et fenestreret afdækning (se materialefortegnelsen) på dyret, og centrer fenestrationen over lændehvirvelsøjlen.
5. Udsættelse af lændehvirvelsøjlen
- Bekræft dybden af anæstesien ved at klemme hver af dyrets poter og se efter fraværet af en abstinensrespons.
- Brug et #11 skalpelblad til at skabe et snit på ca. 3 cm i huden ned langs midterlinjen fra L2 til L6.
- Løsn huden fra musklen ved at indsætte en steril buet kirurgisk saks mellem musklen og huden og derefter åbne spidserne.
- Fjern fascien, der dækker L2-L5 spinøse processer.
6. Isætning af sprøjten
- Pipetter 25-35 μL af vektoren (for at opnå den ønskede dosis) i hætten på et sterilt mikrocentrifugerør.
- Træk hele volumen op i insulinsprøjten.
BEMÆRK VENLIGST: Pas på ikke at trække luft op under denne proces.
7. Udførelse af injektionen
- Identificer L5- og L4-spinøse processer.
BEMÆRK: L6 sidder direkte mellem de to hoftekamme, og dens rygsøjleproces skal være let at identificere ved at sondere med et stump instrument. Instrumentet kan derefter forsigtigt køres op ad ryggen for at finde grænserne for L5- og L4-processerne. - Placer den ene hånd, så tommelfingeren hviler forsigtigt på dyrets hale og det ene ben. Brug en finger til at stabilisere sprøjten.
- Placer sprøjtens nål, så den er til venstre for L5-spinøs proces og på linje med dens haleende. Placer sprøjten, så den er ca. 30° fra midterlinjen og 30° op fra bordets plan.
BEMÆRK VENLIGST: Det kan være nyttigt at bruge et kirurgisk mikroskop til bedre at identificere landemærker og placere spidsen af nålen. - Før sprøjtenålen ca. 8 mm fremad over toppen af L5-laminaen og derefter under L4-laminaen ind i lændecisternen, indtil knoglen er ramt. Korrekt placering vil resultere i et ryk i benet og/eller halen, som kan ses eller mærkes ved tommelfingeren, der hviler på benet/halen. Hvis der ikke er nogen trækninger, skal du fjerne nålen og prøve proceduren fra venstre side. Hvis der stadig ikke er nogen trækninger, skal du gentage proceduren mellem L4/L3 og L3/L2 efter behov.
- Tryk stemplet langsomt ned i ca. 5 sekunder.
BEMÆRK: Der kan være en trækning i benet eller halen under injektionen. - Hold sprøjten på plads i ca. 30 sek., efter at stemplet er trykket helt ned, så trykket kan komme i ligevægt og minimere tilbagesvaling af injektiatet, når nålen trækkes ud.
- Fjern langsomt nålen.
8. Lukning af snittet
- Tilnærm kanterne af snittet.
- Begynd i den ene ende af såret, brug en 4-0 sutur (se materialetabel) eller kirurgiske hæfteklammer til at lukke snittet.
9. Genopretning og overvågning
- Placer dyret i det forvarmede bur.
- Tjek dyret mindst hvert 15. minut, indtil det er helt gangende.
BEMÆRK: Dette bør tage mellem 15 min og 45 min. - I de næste tre dage skal du udføre sundhedstjek mindst dagligt. Giv smertestillende midler i de første 2 dage efter operationen eller som krævet af IACUC.
- En uge efter operationen skal du fjerne suturerne eller hæfteklammerne.
10. Procedure for opfølgning
BEMÆRK: For at bestemme nøjagtigheden af injektionsteknikken skal du injicere trypanblåt farvestof som beskrevet ovenfor og derefter straks aflive dyret (i henhold til institutionelt godkendte protokoller) og udføre en laminektomi for at visualisere resultatet.
- Mens dyret forbliver under anæstesi, aflives det ved at administrere en dødelig dosis pentobarbital via intraperitoneal injektion i en dosis på 150 mg/kg.
- Når åndedræt og hjerteaktivitet ophører, skal du åbne brysthulen for at sikre døden. Forlæng det kirurgiske snit op ad ryggen til nakken.
- Lav et snit på 4 cm langt ind i musklen parallelt med rygsøjlen på begge sider af de spinøse processer, og hold dig så tæt som muligt på processerne.
- Brug en fin pincet eller saks til at fjerne musklen mellem de spinøse processer.
- Fjern spinøse processer fra L6 op til den nedre thorax rygsøjle ved hjælp af en rongeur (se materialetabel). Undgå vridende bevægelser, da dette kan beskadige rongeurs.
- Indsæt den nederste spids af rongeur under L5-laminaen, og fjern knoglen, der ligger over rygmarven, ved at tage flere "bid" ud af den.
BEMÆRK VENLIGST: At trække L6 spinøs proces tilbage kan gøre det lettere at indsætte spidsen af rongeuren. Der skal udvises forsigtighed for at forhindre beskadigelse af rygmarven. - Fortsæt med at udvide laminektomien mindst fire laminae rostralt. Undersøg den indvendige overflade af lamellerne for tegn på farvestof, hvilket kan indikere en mislykket injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme nøjagtigheden af injektionsteknikken blev et farvestof, trypanblåt, brugt som surrogat for det terapeutiske. Dette farvestof binder sig let til proteiner, så det forbliver generelt inden for den struktur, som det blev injiceret i. Det betyder, at farvestoffet muligvis ikke nøjagtigt forudsiger fordelingen af det terapeutiske middel efter injektion; Det bruges simpelthen til at afsløre nøjagtigheden af injektionen. Når det er lykkedes at indføre i lændecisternen, binder trypanblåt sig til dura mater og pletter rygmarvens omkreds blå. Men når nålen ikke trænger ind i dura mater, ender farvestoffet i epiduralrummet. Både dura mater og det omgivende væv (overfladen af knoglen og ledbåndene og musklerne, der forbinder laminae) vil blive farvet blåt. Disse mønstre er let synlige for det blotte øje.
Forskellen mellem korrekt og forkert administreret injektion er svær at vurdere, hvis man blot laver et tværgående snit gennem rygmarven og rygsøjlen. I stedet anbefales det at udføre en laminektomi ved hjælp af et par rongeurs, der begynder ved L5-laminaen og bevæger sig rostralt. Man skal passe på ikke at beskadige dura mater i processen. Brug af dissektionsmikroskopet gør denne proces lettere. Figur 1 giver sammenlignende eksempler på vellykkede injektioner og kun delvist vellykkede injektioner. Ved en vellykket injektion observeres lidt eller ingen refluks langs nålesporet, når nålen trækkes tilbage. Efter en vellykket injektion afslører fjernelse af laminaen for at blotlægge rygmarven trypanblåt i rygmarven, men ikke på overfladen af knoglen (figur 1A). Farvestoffet er også synligt på hjernestammen og lillehjernen efter en vellykket injektion (figur 1B). I modsætning hertil er en delvist vellykket injektion bevist ved betydelig tilbagesvaling af farvestof tilbage op ad nålekanalen under injektionsprocessen og/eller synlige tegn på farvestof på knoglen (figur 1C).
Ved hjælp af ovenstående procedure blev 28 μL af en AAV9-vektor, der udtrykker forstærket grønt fluorescerende protein (GFP), injiceret i en koncentration på 3 x 1013 vektorgenomer/ml til en samlet dosis på 8,4 x 1011 vektorgenomer/dyr. Fire uger senere blev dyrene aflivet og perfusioneret med 4% paraformaldehyd10. Hjernen og rygmarven blev derefter høstet og forberedt til frossen sektionering. 40 μm tykke sektioner blev opnået og farvet til GFP. Figur 2 giver eksempler på transduktionsmønsteret opnået med denne vektor. Transduktionen var generelt højest i rygmarven, især i lænderegionen (figur 2A-C), sandsynligvis på grund af dens nærhed til injektionsstedet. Transduktionen af hjernen blev opnået (figur 2D-F), men som forventet havde den en tendens til at være mere begrænset end det, der sås i rygmarven.
For at illustrere reproducerbarheden af resultater opnået af en enkelt, erfaren kirurg ved hjælp af et enkelt parti virus, er farvede sektioner af lillehjernen og cortex fra hver af de 15 rotter, der blev injiceret til denne undersøgelse, vist i henholdsvis figur 3 og figur 4. De farvede snit af den cervikale rygmarv er også præsenteret for 7 af disse 15 rotter (figur 5). Selvfølgelig kan mængden af hjernetransduktion vise endnu større variation med forskellige doser, vektorpartier og kirurger10.
Figur 1: Eksponering af rygmarven efter en injektion af farvestoffet. Laminektomier blev udført efter injektion af trypan blåt. (A) Rygmarven farves blåt i en korrekt administreret injektion, og der ses intet farvestof på knoglen, der fjernes under laminektomien (pile). (B) Farvestoffet kan også observeres omkring hjernestammen. (C) I en injektion, hvor der var betydelig refluks under injektionen, er der mindre farvestof i strengen, og farvestof er til stede på overfladen af knoglen (pile). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempler på transduktionsmønstre opnået efter intratekal levering af AAV9-GFP. 40 μm tykke sektioner af (A) cervikal, (B) thorax og (C) lumbal rygmarv blev immunhistokemisk farvet for GFP (sort plet). Høje niveauer af transduktion af grå substans blev observeret på alle niveauer. (D) I modsætning hertil udviser hjernen en tyndere samlet transduktion. Venstre og højre boks forstørres i henholdsvis (E) og (F). (E) Størstedelen af farvningen observeres i lillehjernen, primært i Purkinje-neuroner (pile). (F) Neuroner (pile) og astrocytter (pilespidser) transduceres i hjernebarken. Skalabjælker: (A-C) 325 μm; D) 5 mm og (E,F) 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Reproducerbarhed af transduktion i lillehjernen. Reproducerbarhed af transduktion i lillehjernen hos 15 rotter, der blev injiceret af den samme kirurg med samme dosis og parti af virussen. Skalastang: 1 mm. Tallene på billederne angiver rotte-ID-numrene ('kuld'.' individ«). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Reproducerbarhed af transduktion i cortex. Reproducerbarhed af transduktion i cortex hos 15 rotter injiceret af den samme kirurg ved hjælp af samme dosis og parti virus. Skalastang: 500 μm. Tallene på billederne angiver rotte-ID-numrene ('kuld'.' individ«). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Reproducerbarhed af transduktion i cervikal rygmarv. Reproducerbarhed af transduktion i cervikal rygmarv hos 7 rotter injiceret af den samme kirurg ved hjælp af samme dosis og parti virus. Skalastang: 500 μm. Tallene på billederne angiver rotte-ID-numrene ('kuld'.' individ«). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En lang række sygdomme påvirker CNS. At give en funktionel kopi af det relevante gen via en viral vektor er en attraktiv behandlingsstrategi for dem, der er recessive og monogene af natur, såsom spinal muskelatrofi. Blod-hjerne-barrieren (BBB) udelukker dog de fleste genterapivektorer, der gives intravenøst11. De, der kan krydse BBB, såsom AAV9, skal gives i høje doser for at overvinde vektortabet på grund af perifer transduktion12. Alderen er også en barriere. Miljøeksponering for de forskellige AAV-serotyper stiger med13-årsalderen og fører ofte til produktion af antistoffer, der kan neutralisere terapeutiske vektorer14. Derfor er intravenøs levering af genterapivektorer for CNS-lidelser generelt begrænset til spædbørn og anvendes ikke til patienter, der diagnosticeres senere i livet.
For ældre patienter kan direkte vektorinjektion i CSF give bred transduktion i CNS, der omgår både BBB og allerede eksisterende anti-AAV-antistoffer15. Da denne tilgang er målrettet, kan lavere vektordoser også anvendes. Der er to primære tilgange i den kliniske indstilling: (1) lumbalpunktur og (2) injektion i de laterale ventrikler. Sidstnævnte indebærer større risiko, men giver generelt større hjernetransduktion. Lumbalpunktur er sikrere, men transduktion er skæv mod rygmarven. Hjernetransduktion kan forbedres ved at placere patienten i Trendelenburg-positionen, men data om dette er blandede 16,17. Brugen af et kateter til at nå cisterna magna via en lumbalpunktur kan give en bedre mulighed i klinikken, men det er i en tidlig fase af brugen5. Der kan være andre udfordringer ved at oversætte tilgange, der er udarbejdet i dyremodeller, til klinikken, såsom vektortab på grund af CSF-lækage18 og toksicitet i de dorsale rodganglier19.
De fleste undersøgelser af CNS-rettede behandlinger udført på gnavere bruger nyfødte eller voksne dyr (>60 dage). Nyfødte har fordelen af en lille kropsstørrelse, der giver mulighed for højere effektive doser og et umodent immunsystem, der undgår komplikationerne af et immunrespons mod det terapeutiske. Men med hensyn til hjernens udvikling repræsenterer en nyfødt mus eller rotte bedre et fosterstadium hos mennesker. For terapier beregnet til børn i aldersgruppen 5-10 år er den unge rotte (25-35 dage gammel) en bedre model med hensyn til neurologisk udvikling20. Da en metode til intratekal injektion ikke tidligere var beskrevet til unge rotter, og metoder etableret til voksne mus og rotter viste sig at være ineffektive hos rotter i denne alder, blev den ovenfor beskrevne fremgangsmåde udviklet. For at være klar, er unge rotter ikke kun mindre end voksne, men kan også variere i elasticiteten af dura, der beskytter rygmarven, hvilket gør en procedure, der virker til at punktere dette lag hos en voksen rotte, ineffektiv hos en ung.
Når man lærer at udføre intratekal injektion hos unge rotter, er det nødvendigt at bruge et farvestof (såsom trypanblåt) som surrogat for terapien, og brugeren bør være meget sikker på deres evne til at udføre proceduren med succes og reproducerbart, før en undersøgelse med et terapeutisk middel påbegyndes. At blive dygtig til teknikken vil kræve øvelse for at få erfaring med, hvordan sprøjten føles, når banen er på mål versus uden for målet. Der er to almindelige fejl. Hvis tilgangsvinklen er for lav, vil nålen ramme toppen af en af lamellerne eller bagsiden af den rostrale lamina. Der vil ikke være nogen trækninger, og afstanden, som nålen bevæger sig frem, vil være et par millimeter under 8 mm. Hvis tilgangsvinklen er for stor, er der risiko for, at nålen passerer mellem de to lameller og trænger ind i bughulen. Når dette sker, vil nålen gå meget længere frem end 8 mm. Hvis dette sker, skal du fjerne nålen, flytte og prøve igen. I de få tilfælde, hvor dette er sket, har det ikke forårsaget nogen tilsyneladende varig skade på dyrene at komme ind i bughulen med et par millimeter før tilbagetrækning og repositionering.
Det har vist sig, at observation af en fysisk reaktion på placeringen af nålen er afgørende for at opnå reproducerbarhed med en høj succesrate med denne procedure. Når der ikke var noget svar, var succesraten for injektionen lav. Men i nogle tilfælde krævede et dyr forsøg på flere steder for at opnå en respons, og spormængder af farvestof blev observeret i et eller flere af de tidligere nålespor. Der blev ikke observeret noget farvestof i epiduralrummet, hvilket tyder på, at nogle af de tidligere nålestik var trængt ind i dura uden at producere en trækning i halen eller benet. Da refluksen var minimal (svarende til det, der observeres i nålesporet fra injektionen), menes det, at effekten af tidligere nålestik på leveringseffekten i disse tilfælde var ubetydelig.
Når man opnår færdigheder i fødselsteknikken, kan man støde på en anden, ikke-kirurgisk udfordring. Specifikt hos voksne rotter (~70 dages alderen) kan styrken af AAV9-vektorer til intratekal levering til rygmarven og hjernen variere betydeligt fra parti til parti, selv når de genereres af den samme vektorkerne. Nogle batcher vil fungere som forventet, hvilket giver transduktion i rygmarvens grå substans langs dens længde. Andre vil dog ikke trænge igennem den grå substans, primært ved at transducere dorsale rodganglier10. Årsagen til denne variation er uklar, da vektorerne er potente in vitro , og når de injiceres direkte i rygmarven. Det anbefales, at der udføres en pilotundersøgelse af 3-4 dyr med et nyt parti virus for at bekræfte, at det nye parti fungerer som forventet, før en stor undersøgelse påbegyndes. Styrken kan vurderes ved hjælp af enten immunhistokemisk eller immunfluorescensfarvning af proteintransgenproduktet eller kvantificering af mængden af transgen-mRNA- eller vektorgenomer ved hjælp af kvantitativ PCR eller ddPCR21. Ud over de ukendte variabler, der adskiller virale partier, kan små forskelle i dyrets alder, injektionsvolumen, leveringshastighed og vektorkoncentration forårsage variation i resultaterne. Før en stor undersøgelse påbegyndes, skal de muligvis optimeres til hver virus eller anden kandidatterapeutisk middel.
Når en erfaren kirurg er uddannet, kan den gennemføre den intratekale injektionsprocedure af en ung rotte inden for ca. 30 minutter, fra anæstesiinduktion til begyndelsen af restitutionsperioden. Dette gør det muligt at behandle store kohorter på kort tid. Genopretningen efter operationen er også hurtig. De fleste dyr vandrer normalt inden for 20-30 min. Efter at have udført mere end 200 af disse operationer er der ikke stødt på nogen bivirkninger fra denne procedure.
Endelig er det altafgørende overvejelser at minimere dyrenes nød og sikre dyrevelfærd under kirurgiske indgreb. Således kræves korrekt brug af bedøvelsesmidler og smertestillende midler, og kropstemperaturen skal opretholdes under proceduren, og indtil dyret kommer sig helt efter anæstesi. De relevante tilsynsorganer og veterinært personale i forskellige institutioner kan have forskellige krav og anbefalinger vedrørende disse emner. Brugen af bedøvelsesmidler og smertestillende midler beskrevet i denne procedure blev udviklet i samråd med Emory Universitys dyrlæger og IACUC-personale. Forskere bør arbejde tæt sammen med deres lokale dyrlæger og IACUC for at nå de nødvendige mål.
Der er visse begrænsninger i denne procedure. Den metode, der er beskrevet her, blev udviklet til brug hos unge rotter, og utallige strukturelle og andre forskelle mellem mennesker og rotter kan begrænse oversættelsen af disse procedurer til mennesker. Formålet med at muliggøre lumbal intratekal injektion af et terapeutisk middel hos unge rotter er at lette brugen af juvenil rottemodel til at teste effektiviteten af den terapeutiske kandidatbehandling - selv om den præcise leveringsmåde skal ændres for at kunne anvendes til patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Donsante er opfinder på et verserende patent vedrørende CSF-administration af AAV9-vektorer.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi og Lacey Stearman fra UT Southwestern for en produktiv diskussion af udfordringen med unge rotter til intratekal injektion. Dette arbejde blev delvist støttet af finansiering fra Jaguar Gene Therapy (til JLFK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A.
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
