Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l'embryogenèse
Summary
La fonction des gènes peut être obscurci dans la perte de fonction des expériences s'il ya compensation par un autre gène. Le modèle de poisson zèbre offre un relativement haut-débit moyen de révéler de telles redondance fonctionnelle dans les embryons vivants.
Abstract
La fonction des gènes durant l'embryogenèse est généralement définie par une perte de fonction des expériences, par exemple par mutagenèse ciblée (KO) chez la souris. Dans le modèle de poisson zèbre, efficaces techniques de génétique inverse ont été développées en utilisant la micro-injection d'morpholinos antisens spécifiques du gène. Morpholinos cibler un ARNm grâce à l'appariement de bases spécifiques et la fonction des gènes bloquer transitoirement par la traduction ou de l'inhibition de l'épissage pendant plusieurs jours lors de l'embryogenèse (à plat). Cependant, chez les vertébrés tels que souris ou le poisson-zèbre, certaines fonctions des gènes peut être obscurcie par ces approches en raison de la présence d'un autre gène qui compense la perte. Cela est particulièrement vrai pour les familles de gènes contenant des gènes soeur qui sont co-exprimés dans les mêmes tissus en développement. Dans le poisson-zèbre, une compensation fonctionnelle peut être testée de manière relativement haut-débit, par co-injection de morpholinos que knockdown cible des deux gènes simultanément. De même, en utilisant morpholinos, une interaction génétique entre deux gènes peut être démontrée par knockdown des deux gènes ensemble à des sous-niveaux de seuil. Par exemple, morpholinos peut être titrée de telle sorte que ni le knockdown individuelles génère un phénotype. Si, dans ces conditions, la co-injection des deux morpholinos provoque un phénotype, une interaction génétique est indiquée. Ici nous démontrons comment montrer la redondance fonctionnelle dans le contexte de deux facteurs de transcription GATA liées. Facteurs GATA sont essentiels pour la spécification des progéniteurs cardiaques, mais ce n'est révélée que par la perte des deux Gata5 et Gata6. Nous montrons comment réaliser des expériences de micro-injection, de valider les morpholinos, et évaluer le phénotype compensé cardiogenèse.
Protocol
Discussion
Dans l'expérience décrite ici, on a combiné deux morpholinos, chacune d'elles génèrent à eux seuls une gamme distincte de phénotypes, et a trouvé un phénotype tout à fait différent quand ils ont été co-injectés ensemble. Bien sûr, nous avions besoin d'une justification pour faire cette expérience, en premier lieu. Nous supposions que les deux gènes pourraient compenser les uns les autres pour une fonction plus tôt, dans cette spécification cas cardiaques. C'est parce que les gènes son…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Evans pour leur aide dans la préparation de cette présentation. Le morpholinos utilisés ici ont été à l'origine validée par le Dr Audrey Holtzinger. TE est soutenu par des subventions du National Institutes of Health (HL064282 et HL056182). Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l'Institut pour la protection des animaux et du Comité utilisation, du Collège médical Weill Cornell.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
