마우스에 utero 서바이벌 수술 개발하는 동안 유전자 발현의 분자 조작 수 있습니다. 여기 우리는 배아 하루 마우스 뇌 (E) 9.5에 retroviral 벡터의 주사를 안내 고주파 초음파 이미징의 사용을 설명합니다.
마우스에 utero 서바이벌 수술 개발하는 동안 유전자 발현의 분자 조작 수 있습니다. 이번에는 질 벽에 일찍 embryogenesis 동안 불투명이기 때문에 그러나, microinjection에 대한 배아의 특정 부분을 대상으로 능력이 크게 제한됩니다. 다행히도, 고주파 초음파 이미징 관심의 배아 지역에 microinjection 바늘 안내를 실시간으로 사용할 수있는 이미지의 생성을 허용합니다. 여기 우리는 배아 하루 마우스 forebrain의 심실 시스템 (E) 9.5에 retroviral 벡터의 주사를 안내하기 위해 이미지의 사용을 설명합니다. 이 방법은 자궁 뿔에 접근하고, 그들이 몇 군데와 주입하는 동안 호수에서 목욕하는 호스트 배아를 허용 특별히 고안된 접시를 허용하는 개복술을 사용합니다. 성공적인 수술은 종종 대부분 또는 주입된 배아의 모든 관심의 후속 시점 (embryonically 또는 postnatally)에 생존의 결과. 여기에서 설명한 원칙 E8.5 태아의 amnionic 유체 (따라서 아직 해결되지 않은 신경 튜브의 앞쪽에 후부 범위 따라 감염을 허용)에 주사를 수행하기 위해 약간의 수정과 함께 사용할 수있는, 또는의 심실 시스템으로 E10.5/11.5에서 뇌. 또한, 중간 neurogenic 세 (~ E13.5)에서 초음파 영상은 바이러스 감염이나 세포 이식에 대해 특정 뇌 영역에 직접 주사를 사용할 수 있습니다. 마우스에 utero 주사에 가이드 초음파 이미징의 사용은 달리 예외적으로 어려운이 없다면 불가능하다 방식으로 마우스 배아의 분자 및 세포 조작을 허용하는 매우 강력한 기술입니다.
amniotic 색과 심실 시스템을 모두 E9.5 – E11.5에서 주입 수 있지만 초음파 가이드를 사용하여 바이러스 주사는 amniotic 색이 E8.5에서 주입 수 있습니다 E8.5 – E11.5,에서 진행하실 수 있습니다. 제대로 수행되면, 초음파지도를 사용하여 심실 시스템에 주입 바이러스 입자 따라서 forebrain (네크로 텍스, 기저 신경, diencephalon, 눈, 등), midbrain의 다양한 구조를 감염시킬 수 있습니다, 심실 시스템을 내벽 세포에 대한 액세스 권한을 가지고 그리고 hindbrain (Figure1C). amniotic 색에 주입 바이러스는 배아의 외부에있는 세포에 액세스할 수 있습니다. 바이러스 이외에 초음파 안내도 개발 배아에 세포를 주입하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서이 기술은 실험을 디자인할 때 (발달 기간, 구조, 바이러스 / 세포)에서 선택할 여러 옵션을 제공합니다.
이것은 주입된 바이러스 또는 세포가 감염 / 주입 세포 쉽게 식별 기자를 표현하는 것은 매우 중요합니다. 역사적으로, 인간 placental 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (PLAP) 또는 GFP가 사용되었습니다. 경험에서, 우리는 PLAP histochemical과 immunohistochemical 얼룩 모두 샤프하고 뚜렷한 하나의 세포 하나가 세포 형태와 위치를 분석할 수 있도록하는 얼룩 및 clonal 분석을 수행하기 위해 수익률 때문에 PLAP은 매우 유용한 리포터 유전자 수 있습니다 나타났습니다. 바이러스성 GFP의 표현이 희미 수 있기 때문에, GFP의 기자 조직 염색법 적합하지 않을 수 있습니다,하지만 그 중 하나가 형광 활성 세포 분류 (외과)에 의해 하나의 세포를 얻기 원한다면 유용합니다.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Micromanipulator | Narishige | 91084361683D | ||
HI-7 pipette holder | Narishige | 9108436141 | ||
10 mm support arm | Carl Zeiss | 9108436206 | ||
IP iron base plate | Carl Zeiss | 9108436167 | ||
CI-1 connector for pipette holder | Carl Zeiss | 9108436257 | ||
1mm ID tubing | Carl Zeiss | 911013 | ||
3-way luer lock stopcock (pkg 10) | Carl Zeiss | K420163-4503 | ||
Motor controller, 2-4 axes | Newport | 860-c2 | ||
Joystick | Newport | PMC200-J | ||
Micrometer adapter | Newport | ADAPT-BM17-375 | ||
Motorized drive | Newport | CMA-25CC | ||
Cable assembly | Newport | 860I-10 | ||
25 mm translation stage | Newport | UMR8-25 | ||
Micrometer | Newport | BM17-25 | ||
Base plate | Newport | M-PBN8 | ||
Inner mounting bracket | Newport | EQ80-I | ||
Outer mounting bracket | Newport | EQ80-E | ||
Man. infusion/withdrawl pump | Stoelting | 51222 | ||
25 μl microsyringe | Stoelting | 51113 | ||
24″x12″x0.5″ metric board plate | Edmund | NT03-640 | ||
Set of self-adjusting feet | Edmund | NT34-841 | ||
Bar-type lens holder | Edmund | NT03-669 | ||
Right angle post clamp | Edmund | NT53-357 | ||
2″ post holder | Edmund | NT03-646 | ||
4” steel post | Edmund | NT36-499 | ||
6” steel post | Edmund | NT36-503 | ||
12/pk set screws, 1/4-20 x 1/2″ | Edmund | NT03-644 | ||
Additional Materials: | ||||
PBS, pH7.4 | Invitrogen | 10010049 | ||
Slide warmer | Fisher Scientific | Numerous options | ||
Double Edge Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | ||
Borosilicate Glass O.D: 1.0mm, I.D.: 0.05mm | Sutter Instruments | B100-50-10 | ||
1cc Insulin Syringe U-100 27G5/8 | Becton Dickinson | 329412 | ||
Autoclip Applier | Becton Dickinson | 427630 | ||
Autoclips, 9mm (to close skin incision) | Becton Dickinson | 427631 | ||
5.0 Silk sutures | Fisher | S-1173 | ||
Sterilube ophthalmic ointment | Fera pharmaceuticals | 48102-012-35 | ||
MB-10 or equivalent disinfectant | Quip labs | |||
10% bleach | Multiple sources |
“One of the following ultrasound backscatter microscopes can be used for this procedure. Although in the video the P40 from Paradigm-Medical is used, the P40 is no longer commercially available, and has been replaced by the P60, which is similarly priced and can be used for the same application. The additional materials described for stage construction are for use with Paradigm-Medical device(s). The Vevo 2100 comes with equipment for small animal imaging.
Anesthetic and Analgesic
The Nembutal solution (50 mg/mL injectable sodium pentobarbital; produced by Abbott laboratories) can be obtained from Bulter Schein Animal Health. Note that this is a schedule II controlled substance and requires a Drug Enforcement Agency (DEA) license to obtain.
The Bupivacaine solution (0.25%; produced by Hospira, Inc, among others) can be obtained from a number of distributors, including Moore Medical.