1. Оптические компоненты Лазерной абляции для лазерной абляции электрораспылением ионизации (LAESI) масс-спектрометрии (MS) производится 5 нс лазерного импульса на 2,94 мкм длиной волны. Перестраиваемый оптический параметрический генератор управляется Nd: YAG лазера (Opolette 100, Opotek Inc, Карлсбад, Калифорния) используется для абляции в данном исследовании. Частота повторения выбирается от 5 до 100 Гц. Это лазер класса IV, что при прямом воздействии может привести к серьезному повреждению глаз или кожи. Диффузного отражения лазерного луча также может быть опасно для кожи и глаз. Надевайте соответствующие очки лазер для защиты. Оптического волокна сделаны из диоксида германия основе стекла была получена из инфракрасных Fiber Systems, Inc (Silver Spring, MD). Если Есть Hytrel и полиимидных покрытий на волокна следуйте инструкциям ниже, чтобы удалить их из концов. Тепло 1-метил-2-пирролидон на 130-150 ° С в вытяжном шкафу. Dip концов волокон вы хотите полосу в этой жидкости в течение примерно 1 мин или пока покрытие начинает смягчаться и шелушиться. Падение смягчил покрытия в метанол или изопропиловый спирт на минуту, и протрите все оставшиеся покрытие с безворсовой салфеткой. После снятия покрытия, расщепляющие обоих концах волокна с сапфиром лезвия (Kitco волоконной оптики, Вирджиния Бич, Вирджиния), забив и мягко щелкая их. Для достижения желаемого резкость, химически травления одного конца волокна наконечник на 1% (об. / об), азотной кислоты (реагент класс) решение. Вертикально погрузиться выбран конце волокна в кислотный раствор на глубину от 300 до 500 мкм после первого контакта. Примерно через 15 минут после травления, наконечник самопроизвольно отключаться от кислоты поверхности. Это приводит к заостренным наконечником волокна с ~ 15 мкм, радиус кривизны. Полоскание с деионизированной водой для удаления остатков кислоты. Горы травления конца волокна на микроманипулятора (MN-151, Narishige, Токио, Япония) и довести его до непосредственной близости (~ 20 мкм) на поверхности клеток для эффективного осаждения энергии. Держите без травления конце оптического волокна голого волокна патрон (BFC300, Сиския Corporation, Грантс-Пасс, ИЛИ). Для оптического выравнивания, волокна патрон установлен на пять оси переводчик (BFT-5, Сиския Corporation, Грантс-Пасс, ИЛИ). Лазерной энергии (от 0,5 до 1 мДж) вводится в волокно путем фокусировки луча от плоско-выпуклую фторида кальция или просветляющие покрытие линз ZnSe (инфракрасный оптический Продукты, Farmingdale, Нью-Йорк) на его без травления конца. Охраняемые золотых зеркал (PF10-03-M01, Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси) используются, чтобы управлять среднего ИК лазерного луча на фокусирующей линзы. 2. Электроспрей установки Электрораспылением системы можно построить, используя следующие компоненты: металлическое соединение с проводящим наконечником perfluoroelastomer, фитинги, трубы втулки, игольчатые порт (например, U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, соответственно IDEX здравоохранения и наук, Дуб Харбор, Вашингтон), так как плавленый диоксид кремния трубки (например, CT360-100 50 пять Нью Цель Инк, Woburn, Массачусетс). Рекомендуется излучателя выполнен из нержавеющей стали и имеет конический наконечник с 50 мкм идентификатор (например, MT320-50-5-5, Новая цель Inc, Woburn, MA). Подготовка 50% раствора метанола с 0,1% уксусной кислоты (об. / об) для электрораспылением. Раствор перекачивается в размере от 200 до 300 Нл / мин шприцевой насос (Harvard Аппарат, Холлистон, М. А.), используя, например, 500 мкл шприц (81 222, Гамильтон компании, Рино, штат Невада). Применение высокого напряжения между 2800 и 3000 В до металлическое соединение по регулируемому источнику питания (PS350, Stanford Research Systems Inc, Саннивейл, Калифорния), чтобы создать устойчивый электрораспылением. Убедитесь, что все электрические соединения выполнены надежно и экранированных с экранированием заземлены. Прямой контакт с открытыми высокое напряжение может привести к поражению электрическим током. 3. Пример обработки Получить жить тканей или клеток выборки из соответствующего источника и держать их в соответствии с рекомендациями перед анализом. Allium сера луковицы для этой демонстрации были приобретены у местного магазина. Вырезать луковица продольно от хирургического скальпеля. Несколько сегменте сантиметр шкала подразделяется на полосу. Нетронутым монослой внутренней эпидермальный ткань снимают. Мокрой поверхности эпидермиса используется для монтирования ткани на предварительно очищенное микроскопический слайд стекла. Держите слайд общим держателем пластины назначения (FP01, Thorlabs Inc, Ньютон, штат Нью-Джерси), установленных на трехосной перевод почву для позиционирования. Приобретать масс-спектры сразу же после монтажа образцов для предотвращения деградации ячейки. 4. Система визуализации Две длинные расстояния микроскопы используются для выбора элементов для анализа и для поддержания расстояния между заостренным наконечником волокна и клеточной поверхности. Последний устанавливается под 15 ° -30 ° угол, отсчитываемый от поверхности. Эта система состоит из др.Онг расстоянии видео микроскопа (7x оптическим зумом точность, Эдмунд оптики, Баррингтон, штат Нью-Джерси) с 5-кратным бесконечности исправлены объектива (M Plan Apo 5x, Mitutoyo Ко, Канагава, Япония), оснащенных ПЗС-камеры (Marlin F131, Allied Видение Технологии , Stadtroda, Германия) для мониторинга и захвата изображений. Второй видеомикроскоп устанавливается под прямым углом к поверхности образца для визуализации клетки сверху. Эта система обеспечивает визуальную обратную связь для юстировки волокна опрокинуться клетка выбрана для абляции и анализа. Он состоит из 7-кратным оптическим зумом точностью (Эдмунд оптики, Баррингтон, штат Нью-Джерси), оснащенный 10-кратным бесконечности исправлены долгого рабочего линзы расстоянии цели (M Plan Apo 10x, Mitutoyo Ко, Канагава, Япония) и ПЗС-камерой. 5. Приобретение масс-спектрах Включите лазер, электрораспылением и масс-спектрометра, например, квадрупольный время пролета системы (Q-TOF премьер, Воды, Милфорд, штат Массачусетс). Оптимизация геометрии ионного источника LAESI, регулируя положение пятна абляции и электрораспылением излучателя по отношению друг к другу и отверстие масс-спектрометр для достижения максимальной интенсивности ионов. Выберите ячейку, представляющие интерес для анализа с помощью верхнего зрения системы визуализации. После выбора, перемещения образца этапе довести выбранную ячейку непосредственно под заостренным кончиком оптического волокна. Использование бокового обзора микроскопа корректировке носа до поверхности клетки расстояние до ~ 20 мкм. Пожар лазерных импульсов на выбранной ячейки по травлению кончик волокна. Это приводит к перфорации клеточной стенки и выброс в цитоплазму в виде твердых частиц. После postionization по электрораспылением, образующихся ионов собираются масс-спектрометр и масс-спектры записаны. После сбора данных, поставить лазер, электрораспылением и масс-спектрометра в режиме ожидания или выключать их. Держите удаленной А. сера образец ткани для дополнительных наблюдений с помощью световой микроскопии. 6. Представитель Результаты Успешное удаление отдельных результатов ячейку в лопнул клеточную стенку и набор масс-спектр LAESI. Неудачного эксперимента обычно не приводит к абляции и / или не масс-спектре. Для демонстрационных целей, мы представляем результаты LAESI-МС анализа одного встроенного эпидермальный ячейке А. сера лампочки. На рис.2 показаны представитель оптического изображения микроскопии после отбора проб клеток. Клеточная стенка перфорированные и степени перфорации ограничено границ с соседними клетками. Соседние ячейки кажутся нетронутыми. Рисунок 2б показывает, представитель массы LAESI спектр производится из клетки. Широкий спектр ионов обнаруживаются от А. сера клеток и на основе их точные массы, структуры изотопа распределения, и, в некоторых случаях и тандемной масс-спектры, они предварительно назначены эндогенных метаболитов. Ионы обнаружены из одной клетки были похожи на те, наблюдается в анализе той же ткани обычными LAESI-MS нескольких ячеек 13. Рисунок 1. Схема одного анализа ячейки LAESI-МС. Среднего ИК лазерного импульса вводится в оптическое волокно и доставляется образец на стекле. Заостренным наконечником волокна фокусирует свет в клетки-мишени и хранение энергии всплесков клетки. Производится удаление шлейфа (красные точки) сливается с электрораспылением шлейфа (черные точки) капли сливаются (зеленые точки), в результате образец конкретного производства иона. Эти ионы анализируются и обнаружено масс-спектрометр (MS). Две большие расстояния видео микроскопы, микроскоп 1 и 2 микроскоп, используются для контроля расстояния между острием волокна и на поверхности клеток и выбрать ячейку для анализа, соответственно. На рисунке 2а. Абляция отпечаток на одну ячейку эпидермальный А. сера лампочки. Соседние ячейки не проявляют видимых повреждений, а затем могут быть проанализированы отдельно. На рисунке 2б. Масс-спектр соответствует удаление одного A. сера эпидермальный ячейка показывает наличие первичных и вторичных метаболитов.