Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia
Summary
Tutta la tecnica di coltura degli embrioni del mouse ci permette di cultura e di embrioni di ratto<em> Ex vivo</emCondizione> durante i periodi limitati corrispondenti a fasi midgestation. In questo protocollo video, abbiamo dimostrato le nostre procedure standard di coltura degli embrioni di ratto dopo tutto E12.5 con il rotore di tipo sistema cultura bottiglia.
Abstract
Intera coltura degli embrioni (WEC), la tecnica è stata sviluppata nel 1950 da New e dei suoi colleghi, e applicato per la biologia dello sviluppo 1. Anche se lo sviluppo e la crescita di embrioni di mammifero sono criticamente dipendente dal funzionamento della placenta, WEC tecnica ci permette di topo cultura e di embrioni di ratto condizione di ex-vivo durante i periodi limitati corrispondenti a fasi midgestation durante il giorno embrionale (E) 6,5 E12.5 nel mouse o E8.5-E14.5 nel ratto 2, 3, 4. In WEC, possiamo direttamente target desiderato aree di embrioni con fini di vetro capillari, perché gli embrioni possono essere manipolati al microscopio. Pertanto, WEC roditore è una tecnica molto utile quando si vogliono studiare i processi di sviluppo dinamico di postimplanted embrioni di mammifero. Fino ad oggi, diversi tipi di sistemi sono stati sviluppati WEC 1. Tra questi, il rotore di tipo sistema di coltura bottiglia è più popolare e adatto a lungo termine cultura di embrioni a midgestation, cioè dopo la E9.5 e E11.5 nel topo e ratto, rispettivamente 1. In questo protocollo video, dimostriamo il nostro procedure standard del WEC ratto dopo E12.5 utilizzando un modello raffinato del sistema originale dei rotatori, che è stato progettato per nuovi e di Cockroft 5, 6, e introdurre le varie applicazioni della tecnica WEC per gli studi di sviluppo dei mammiferi biologia.
Protocol
Discussion
Ci sono due passaggi critici nel WEC roditori per il successo. In primo luogo, la procedura di dissezione dovrebbe essere accurato per non danneggiare gli embrioni, soprattutto vasi sanguigni. In secondo luogo, la procedura dovrebbe essere il più rapidamente possibile, perché l'ossigeno e nutrienti non sono più forniti attraverso la placenta dopo l'isolamento dall'utero. Questo è fondamentale per i vecchi embrioni. Nel caso del WEC ratto dopo E12.5, dovremmo trasferire embrioni sezionati in bottiglie di …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Sig. Hajime Ichijo per la video-registrazione e consigli utili per l'editing del video. Ringraziamo anche Drs.Yuji Tsunekawa e Kaichi Yoshizaki per gentile assistente per il video-registrazione. Questo lavoro è supportato da KAKENHI su B per giovani scienziati e di priorità Aree-Molecular Brain Science da MEXT del Giappone. Riconosciamo l'appoggio di Global COE Program "Centro di ricerca di base e traslazionale per la scienza del cervello globale" da MEXT del Giappone e il Nucleo di Ricerca per la Scienza e la Tecnologia evolutiva (CREST) da Science e Technology Corporation giapponese di scienza giapponese e Technology Agency (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comment |
| Setting up WEC | ||||
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | – | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | Millipore | SLGS033SS | |
| Anesthesia and isolation of the uterus | ||||
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) |
Tool | Iwaki | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Schering-Plough Animal Health | – | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | – | – | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. |
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles Rivers Laboratories Japan | – | |
| Preparation of culture medium | ||||
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any company | – | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | Becton Dickinson | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles Rivers Laboratories Japan | – | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | Gibco | 15240 | |
| Dissection of embryos | ||||
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | – | – | Made by hand using Pasteur pipette. |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
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