O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa
Summary
Técnica de cultura todo embrião de rato permite-nos cultura e embriões de ratos<em> Ex vivo</em> Condição durante períodos limitados, correspondendo a fases midgestation. Neste protocolo de vídeo, demonstramos nossos procedimentos padrão de cultura de embriões de ratos após toda E12.5 usando o rotator-tipo de sistema de cultura de garrafa.
Abstract
Todo embrião cultura técnica (WEC) foi desenvolvido em 1950 pela Nova e seus colegas, e aplicadas em biologia do desenvolvimento 1. Embora o desenvolvimento e crescimento de embriões de mamíferos dependem criticamente a função da placenta, WEC técnica nos permite rato cultura e embriões de ratos condição de ex vivo durante períodos limitados, correspondendo a fases midgestation durante o dia embrionário (E) 6,5 E12.5 na mouse ou E8.5-E14.5 no rato 2, 3, 4. No WEC, nós podemos diretamente alvo desejado áreas de embriões utilizando capilares de vidro fina porque os embriões podem ser manipulados sob o microscópio. Portanto, WEC roedores é uma técnica muito útil quando queremos estudar processos dinâmicos de desenvolvimento de embriões de mamíferos postimplanted. Até à data, vários tipos de sistemas têm sido desenvolvidos WEC 1. Entre estes, o rotator-tipo de sistema de cultura de garrafa é mais popular e adequada para longo prazo de cultura de embriões em midgestation, ou seja, após E9.5 e E11.5 em camundongos e ratos, respectivamente 1. Neste protocolo de vídeo, demonstramos nossos procedimentos padrão de WEC ratos após E12.5 usando um modelo refinado do sistema original rotador, que foi desenhado por New Cockroft e 5, 6, e introduzir várias aplicações da técnica do CME para estudos em desenvolvimento de mamíferos biologia.
Protocol
Discussion
Existem dois passos críticos no WEC roedores para o sucesso. Primeiro, o procedimento de dissecção deve ser preciso para não danificar embriões, especialmente os vasos sanguíneos. Segundo, o procedimento deve ser o mais rápido possível, porque o oxigênio e nutrientes não são mais fornecidos através da placenta após o isolamento do útero. Isto é crítico para os embriões mais velhos. No caso do WEC de ratos após E12.5, devemos transferir embriões dissecado em garrafas de cultura em 30 minutos.
<p cl…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós agradecemos o Sr. Hajime Ichijo conselhos para a gravação de vídeo e útil para editar o vídeo. Agradecemos também Drs.Yuji Tsunekawa e Kaichi Yoshizaki para assistente de tipo para gravação de vídeo. Este trabalho é apoiado por KAKENHI em B Jovem Cientista ea prioridade Ciência Cérebro Áreas-Molecular de MEXT do Japão. Agradecemos o apoio da Global COE Programa "Centro de Investigação Básica e translacional para a Ciência do Cérebro Global" a partir MEXT do Japão e de Pesquisa Núcleo de Ciência e Tecnologia Evolutiva (CREST) de Ciência japonês e Corporação de Tecnologia de Ciência do Japão e Agência de Tecnologia (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comment |
| Setting up WEC | ||||
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | – | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | Millipore | SLGS033SS | |
| Anesthesia and isolation of the uterus | ||||
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) |
Tool | Iwaki | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Schering-Plough Animal Health | – | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | – | – | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. |
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles Rivers Laboratories Japan | – | |
| Preparation of culture medium | ||||
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any company | – | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | Becton Dickinson | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles Rivers Laboratories Japan | – | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | Gibco | 15240 | |
| Dissection of embryos | ||||
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | – | – | Made by hand using Pasteur pipette. |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
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