La méthode de culture des embryons rongeurs entier en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture
Summary
Whole technique de culture d'embryons de souris nous permet de culture et d'embryons de rat<em> Ex vivo</emCondition> durant des périodes limitées correspondant aux stades midgestation. Dans ce protocole vidéo, nous démontrons nos procédures standard de la culture d'embryon de rat entière après E12.5 en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture.
Abstract
Toute la culture d'embryons (CME) technique a été développée en 1950 par la Nouvelle et ses collègues, et appliquée pour la biologie du développement 1. Bien que le développement et la croissance des embryons de mammifères dépendent de façon critique sur la fonction du placenta, la technique du CME nous permet de culture et de la souris embryons de rat ex vivo état pendant des périodes limitées correspondant aux stades lors de midgestation jour embryonnaire (E) de 6,5 E12.5 dans le souris ou E8.5-E14.5 chez le rat 2, 3, 4. Dans le CME, nous pouvons cibler directement les zones souhaitées en utilisant des embryons fines capillaires en verre car les embryons peuvent être manipulés sous le microscope. Par conséquent, le CME rongeurs est une technique très utile quand on veut étudier les processus dynamiques de développement des embryons de mammifères postimplanted. Jusqu'à ce jour, plusieurs types de systèmes de CME ont été développés 1. Parmi ceux-ci, le système des rotateurs de type flacon de culture est le plus populaire et adapté à long terme de culture d'embryons au midgestation, c'est à dire, après E9.5 et E11.5 chez la souris et le rat, respectivement 1. Dans ce protocole vidéo, nous démontrons notre procédures standard du CME rat après E12.5 en utilisant un modèle raffiné de l'ancien système des rotateurs, qui a été conçu par la Nouvelle et de Cockroft 5, 6, et d'introduire diverses applications de la technique du CME pour les études en développement chez les mammifères biologie.
Protocol
Discussion
Il ya deux étapes essentielles dans la CME rongeurs pour le succès. Tout d'abord, la procédure de dissection doit être juste pour ne pas endommager les embryons, en particulier les vaisseaux sanguins. Deuxièmement, la procédure devrait être aussi rapidement que possible parce que l'oxygène et les nutriments ne sont plus alimentés via le placenta après l'isolement de l'utérus. Cela est essentiel pour les anciens embryons. Dans le cas du WEC rat après E12.5, nous devrions le transfert des embry…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions M. Hajime Ichijo pour des conseils d'enregistrement vidéo et utiles pour l'édition de la vidéo. Nous remercions également Drs.Yuji Tsunekawa et Kaichi Yoshizaki pour l'assistant genre pour l'enregistrement vidéo. Ce travail est soutenu par KAKENHI sur B Young Scientist et sur la science du cerveau domaines prioritaires-moléculaire de MEXT du Japon. Nous reconnaissons l'appui de Global COE Program "centre de recherche fondamentale et translationnelle pour les sciences du cerveau global" du MEXT du Japon et de la recherche de base pour la science évolutive et la technologie (CREST) de la Science et Technology Corporation japonaise de Science and Technology Agency japonaise (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comment |
| Setting up WEC | ||||
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | – | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | Millipore | SLGS033SS | |
| Anesthesia and isolation of the uterus | ||||
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) |
Tool | Iwaki | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Schering-Plough Animal Health | – | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | – | – | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. |
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles Rivers Laboratories Japan | – | |
| Preparation of culture medium | ||||
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any company | – | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | Becton Dickinson | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles Rivers Laboratories Japan | – | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | Gibco | 15240 | |
| Dissection of embryos | ||||
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | – | – | Made by hand using Pasteur pipette. |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
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