Оценка пространственного распределения γH2AX следующие ионизирующих излучений
Summary
Микроскопический анализ γH2AX очагов, которые образуют следующие фосфорилирование H2AX в Ser-139 в ответ на ДНК двунитевых разрывов, стал бесценным инструментом в области радиационной биологии. Здесь мы использовали антитела к моно-метилированных гистонов H3 на 4, как лизин эпигенетических маркеров активное переписывание эухроматин, оценивать пространственное распределение радиационных формирование γH2AX внутри ядра.
Abstract
Ранней молекулярной ответ на ДНК двунитевых разрывов (ДР) является фосфорилирование Ser-139 остаток в мотиве терминал SQEY из гистонов 1,2 H2AX. Это фосфорилирование H2AX опосредовано фосфатидил-inosito 3-киназы (PI3K), семейство белков, атаксия телеангиэктазия мутировал (ATM), ДНК-протеинкиназа каталитической субъединицы и банкоматов и RAD3 связанных (ATR) 3. Фосфорилированные формы H2AX, именуемые γH2AX, распространяется на соседние регионы хроматина с сайта DSB, образуя дискретные фокусы, которые легко визуализируется immunofluorecence микроскопии 3. Анализ и количественное определение γH2AX очаги широко используется для оценки DSB формирования и ремонта, особенно в ответ на ионизирующее излучение и для оценки эффективности различных излучений изменения соединений и цитотоксических соединений 4.
Учитывая изысканные специфичность и чувствительность этого заново маркер ДР, он предоставил новому взглянуть на процессы повреждения и восстановления ДНК в контексте хроматина. Например, в области радиационной биологии центральной парадигмы в том, что ядерная ДНК является критическим цель в отношении радиационной чувствительности. Действительно, общий консенсус в области в значительной степени, чтобы просмотреть хроматина в виде однородной шаблон для повреждения ДНК и ремонта. Однако в связи с использованием γH2AX как молекулярным маркером ДР, неравенство в γ-облучения вызванных γH2AX очагов формирования в эухроматин и гетерохроматин наблюдается 5-7. В последнее время мы использовали панели антител либо моно-, ди-или три-метилированных гистонов H3 на лизина 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), которые являются эпигенетические отпечатки конститутивного гетерохроматина и транскрипционной глушителей и лизин 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), которые тесно связано активное переписывание эухроматиновых регионах, исследовать пространственное распределение γH2AX следующие ионизирующего излучения 8. В соответствии с преобладающим представлениям о хроматина биологии, полученные нами данные указывают на тесную взаимосвязь между γH2AX формирования и активной транскрипции 9. Здесь мы демонстрируем нашу иммунофлюоресценции методом для обнаружения и количественного определения γH2AX очагов не соблюдают клеток, при этом особое внимание на сотрудничестве с другими локализации эпигенетических маркеров, анализ изображений и 3D-моделирования.
Protocol
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержке австралийского Института ядерной науки и техники не будет подтверждено. TCK был удостоен AINSE наград. Эпигеномном Лаборатории медицины при поддержке национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (566 559). Эта работа финансируется за счет CRC для биомедицинской визуализации Development Ltd, созданы и поддерживаются в совместных исследований австралийского правительства с центрами (КПР) программу. Л. М. поддерживается Мельбурне исследований (Университет Мельбурна) и биомедицинской визуализации стипендии CRC дополнительных. Поддержка Micro Монаш Imaging (доктора Стивена Коди и ISKA Кармайкл) был бесценен для этой работы.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore, USA | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam, Cambridge, UK | AB8895 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11035 | |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen, USA | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
| Polylysine slides | Menzel-Gläser, Germany | |||
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Shandon Cytospin 4 | ThermoElectron Corp | |||
| Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
| Filter Cards | Shandon, Inc | 353025 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| PAP Pen | Zymed Laboratories, Invitrogen | 008877 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Bonner, W. M. . Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).
- Cowell, I. G. gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation. PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &, I. l. i. a. k. i. s., G, . Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci. Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).
- Goodarzi, A. A. ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin. Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).
