Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi
Summary
DNA çift iplikli tatili yanıt Ser-139 H2AX fosforilasyon aşağıdaki formu γH2AX odakları, mikroskobik analiz radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada çekirdeğin içinde radyasyona bağlı γH2AX oluşumu uzamsal dağılımını değerlendirmek için, aktif transkripsiyonu ökromatin bir epigenetik işaretleyici olarak mono-metil histon H3 lizin 4 antikor kullanılır.
Abstract
Histon H2AX 1,2 terminal SQEY motifi içinde Ser-139 kalıntı DNA çift iplikli sonları (DSBs) bir erken moleküler yanıt fosforilasyon. H2AX Bu fosforilasyon fosfatidil-inosito 3-kinaz (PI3K) proteinleri aile, ataksi telenjiektazi mutasyona uğramış (ATM), DNA-protein kinaz katalitik subunit ve ATM ve RAD3 ilgili (ATR) 3 aracılı. ΓH2AX olarak anılacaktır H2AX fosforile formu, immunofluorecence mikroskopi 3 kolayca görselleştirildiği ayrık odaklar, şekillendirme, DSB sitesinden kromatin komşu bölgelere yayılıyor. ΓH2AX odakları Analizi ve kantitatif DSB oluşumu ve onarım, özellikle iyonlaştırıcı radyasyon yanıt ve bileşikleri ve sitotoksik bileşikler 4 değiştirerek çeşitli radyasyon etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak değerlendirmek için kullanılır olmuştur.
DSBs bu de novo marker zarif özgüllük ve duyarlılık göz önüne alındığında, kromatin bağlamında DNA hasarı ve onarım süreçleri içine yeni anlayışlar sağladı. Örneğin, radyasyon biyolojisi merkezi paradigma nükleer DNA radyasyon hassasiyeti açısından kritik bir hedef olmasıdır. Gerçekten de, bu alanda genel bir fikir birliği, homojen bir şablon olarak DNA hasarı ve onarımı için kromatin görünüm için büyük ölçüde olmuştur. Ancak, DSBs moleküler marker ökromatin ve heterokromatin γ-ışınlama indüklenen γH2AX odaklarının oluşumu bir eşitsizlik olarak γH2AX kullanımı ile 5-7 görülmüştür. Son zamanlarda, biz antikorların bir panel ya da mono-, di-kurucu heterokromatin ve transkripsiyonel susturulması ve lizin 4 epigenetik diziniz (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 veya lisin 9 tri-metil histon H3 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) ), sıkıca iyonlaştırıcı radyasyon 8 γH2AX uzamsal dağılımını araştırmak euchromatic bölgelerde aktif transkripsiyon ilişkili olduğu. Kromatin biyolojisi ile ilgili hakim fikirleri doğrultusunda, bizim bulgular γH2AX oluşumu ve aktif transkripsiyon 9 arasında yakın bir ilişki göstermiştir. Burada diğer epigenetik belirteçler, görüntü analizi ve 3D modelleme ile co-lokalizasyon belirli bir odak, yapışmaz hücreleri γH2AX odaklarının tespiti ve kantitatif için immünofloresan yöntemi göstermek.
Protocol
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Avustralya Nükleer Bilimi ve Mühendisliği Enstitüsü destek kabul edilmektedir. TCK AINSE ödül layık görüldü. Epigenomic Tıp Laboratuarı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (566.559) Avustralya tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, Biyomedikal Görüntüleme Development Ltd ÇHS tarafından finanse kurulan ve Avustralya Hükümeti Ortak Araştırma Merkezleri (CRC) programı kapsamında desteklenen. LM Melbourne Araştırma (University of Melbourne) ve Biyomedikal Görüntüleme CRC ek burs tarafından desteklenmektedir. Monash Micro Görüntüleme desteği (Dr Stephen Cody ve Iska Carmichael), bu iş için çok değerli idi.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore, USA | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam, Cambridge, UK | AB8895 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11035 | |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen, USA | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
| Polylysine slides | Menzel-Gläser, Germany | |||
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Shandon Cytospin 4 | ThermoElectron Corp | |||
| Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
| Filter Cards | Shandon, Inc | 353025 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| PAP Pen | Zymed Laboratories, Invitrogen | 008877 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Bonner, W. M. . Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).
- Cowell, I. G. gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation. PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &, I. l. i. a. k. i. s., G, . Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci. Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).
- Goodarzi, A. A. ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin. Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).
