Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

Summary

Microscopische analyse van γH2AX foei, welke vorm na de fosforylatie van H2AX op Ser-139 in reactie op DNA dubbelstrengs breuken, is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier hebben we gebruik gemaakt van een antilichaam aan mono-gemethyleerde histon H3 op lysine 4 als een epigenetische marker van actief transcriberen euchromatin, om de ruimtelijke verdeling van de straling-geïnduceerde γH2AX formatie binnen de kern te evalueren.

Abstract

Een vroege moleculaire respons op DNA dubbel-breuken (DSB) is fosforylering van de Ser-139 residu in de terminal SQEY motief van de histon H2AX ^1,2. Deze fosforylatie van H2AX wordt gemedieerd door de fosfatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) familie van eiwitten, ataxie telangiectasia gemuteerd (ATM), DNA-eiwit kinase katalytische subeenheid en ATM en RAD3-gerelateerde (ATR) ^3. De gefosforyleerde vorm van H2AX, aangeduid als γH2AX, verspreidt naar aangrenzende regio's van chromatine van de site van de DSB, de vorming van discrete foei, die makkelijk kunnen worden gevisualiseerd door immunofluorecence microscopie ^3. Analyse en kwantificering van γH2AX foci is op grote schaal gebruikt om de DSB vorming en reparatie, in het bijzonder in reactie op ioniserende straling en voor het evalueren van de effectiviteit van verschillende straling wijzigen verbindingen en cytotoxische verbindingen ⁴ te evalueren.

Gezien de uitstekende specificiteit en gevoeligheid van deze de novo marker van DSB, heeft zij nieuwe inzichten in de processen van DNA-schade en herstel in het kader van chromatine. Bijvoorbeeld, in de biologie straling van de centrale paradigma is dat de kern-DNA is de kritische doelgroep met betrekking tot de stralingsgevoeligheid. Inderdaad, de algemene consensus in het veld grotendeels aan chromatine te zien als een homogene sjabloon voor DNA-schade en reparatie. Echter, met het gebruik van γH2AX als moleculaire marker van DSB's, een ongelijkheid in γ-straling-geïnduceerde γH2AX brandpunten vorming in euchromatin en heterochromatine waargenomen ^5-7. Onlangs hebben we gebruik gemaakt van een panel van antilichamen tegen zowel mono-, di-of tri-gemethyleerd histon H3 op lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), die epigenetische sporen van constitutieve heterochromatine en transcriptionele zwijgen en lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), die nauw gecorreleerd actief transcriberen euchromatic regio's, de ruimtelijke verdeling van γH2AX onderzoeken volgende ioniserende straling ^8. In overeenstemming met de heersende ideeën over chromatine biologie, onze bevindingen wezen op een nauwe correlatie tussen de γH2AX vorming en actieve transcriptie ^9. Hier laten we zien onze immunofluorescentie methode voor de detectie en kwantificering van γH2AX foci in niet-hechtende cellen, met een bijzondere nadruk op co-lokalisatie met andere epigenetische merkers, beeldanalyse en 3D-modellering.

Protocol

Celpreparaat Menselijke erythroleukemic K562 cellen worden gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum en 20 mg / ml gentamicine in een bevochtigde 5% CO 2-omgeving bij 37 ° C. Ongeveer 18 uur voorafgaand aan de kleuring wassen exponentieel groeiende cellen (optimaal bij 5 x 10 5 cellen / ml) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), opnieuw in suspensie in verse media en terug te keren naar 37 ° C, 5% CO 2. Was de cellen …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	Millipore, USA	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam, Cambridge, UK	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen, USA	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Gläser, Germany
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Gläser, Germany	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Falcon	353112
Shandon Cytospin 4		ThermoElectron Corp
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Invitrogen	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices, USA