Évaluation de la distribution spatiale des rayonnements ionisants suivantes γH2AX

Summary

L'analyse microscopique des γH2AX foyers, qui forment la suite de la phosphorylation de H2AX à Ser-139, en réponse à l'ADN des cassures double brin, est devenu un outil précieux dans la radiobiologie. Ici nous avons utilisé un anticorps mono-méthylé histone H3 lysine à 4 comme un marqueur épigénétique de la transcription euchromatine active, afin d'évaluer la distribution spatiale du rayonnement induit par la formation γH2AX au sein du noyau.

Abstract

Une réponse précoce moléculaires de l'ADN double-brin (CDB) est la phosphorylation de la Ser-139 résidus dans le motif de SQEY terminale de l'histone H2AX ^1,2. Cette phosphorylation de H2AX est médiée par la phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) famille de protéines, de l'ataxie télangiectasie muté (ATM), sous-unité kinase ADN-protéines catalytiques et ATM et RAD3 liés (ATR) ^3. La forme phosphorylée de H2AX, dénommé γH2AX, se répand dans les régions adjacentes de la chromatine sur le site de l'ORD, formant des foyers distincts, qui sont facilement visualisés par microscopie à ³ immunofluorecence. Analyse et quantification de γH2AX foyers a été largement utilisé pour évaluer la formation et la réparation ORD, en particulier en réponse aux rayonnements ionisants et pour évaluer l'efficacité de rayonnement différents composés et modifiant composés cytotoxiques ^4.

Compte tenu de la spécificité et la sensibilité exquise de ce marqueur de novo de CDB, il a fourni de nouvelles perspectives dans le processus d'endommagement de l'ADN et la réparation dans le contexte de la chromatine. Par exemple, en radiobiologie le paradigme central est que l'ADN nucléaire est la cible critique à l'égard de la sensibilité aux rayonnements. En effet, le consensus général dans le domaine a été largement pour voir la chromatine comme un modèle homogène pour dommages à l'ADN et la réparation. Cependant, avec l'utilisation de γH2AX comme marqueur moléculaire de la CDB, une disparité dans γ-irradiation formation γH2AX foyers dans l'euchromatine et l'hétérochromatine a été observé ^5-7. Récemment, nous avons utilisé un panel d'anticorps mono-, di-ou tri-méthylé histone H3 lysine 9 au (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), qui sont empreintes épigénétiques de l'hétérochromatine constitutive et le silencing transcriptionnel et lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), qui sont étroitement corrélées activement transcrire régions euchromatiques, pour étudier la distribution spatiale des rayonnements ionisants γH2AX suivantes ^8. En conformité avec les idées dominantes sur la biologie de la chromatine, nos résultats montrent une corrélation étroite entre la formation et la transcription γH2AX actif ^9. Ici nous démontrons notre méthode d'immunofluorescence pour la détection et la quantification des γH2AX foyers dans des cellules non adhérentes, avec un accent particulier sur la co-localisation avec d'autres marqueurs épigénétiques, analyse d'image et de modélisation 3D.

Protocol

Préparation de cellules Homme érythroleucémique K562 cellules sont cultivées dans du RPMI-1640 supplémenté avec 10% (v / v) de sérum bovin foetal et 20 mg / ml de gentamicine dans une atmosphère humidifiée 2 à 5% l'environnement à 37 ° C. Environ 18 heures avant la coloration des cellules en croissance exponentielle laver (optimale à 5 x 10 5 cellules / ml) avec un tampon phosphate salin (PBS), remettre en suspension dans un milieu frais et retour à 37 ° C, 5…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	Millipore, USA	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam, Cambridge, UK	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen, USA	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Gläser, Germany
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Gläser, Germany	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Falcon	353112
Shandon Cytospin 4		ThermoElectron Corp
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Invitrogen	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices, USA