Антиген Конкретные В Vivo Убийство методом с использованием меченых клеток CFSE Целевая
Summary
Многие инфекции вызывают сильные CTL ответ, но время от времени, количество ответ клеток не коррелирует с контролем патогена<sup> 1</sup>. Одним из показателей качества CTL является их способность убивать специально<sup> 2</sup>. CFSE маркировки клеток-мишеней может быть использован для расследования этого CTL качество ответа<em> В естественных условиях</em<sup> 3,4</sup>.
Abstract
Карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил эфира (CFSE) можно использовать, чтобы легко и быстро этикетке клеточной популяции интерес для прижизненного исследования. Это наклеивания этикеток классически были использованы для изучения пролиферации и миграции. В методе, представленных здесь, мы сократили сроки после приемных передачи смотреть на выживание и убийство эпитопа конкретных CFSE меченых клеток-мишеней 4-6. Уровень удельной убийство CD8 + Т-клеток клона может указывать на качество ответа, так как их количество может быть обманчивым. Конкретные CD8 + Т-клеток может стать функционально исчерпаны в течение долгого времени со снижением продукции цитокинов и убийства 7,8. Кроме того, некоторые клоны CD8 + Т-клеток, возможно, не убивать, а также другие с различными TCR особенности 9. Для эффективного иммунитета опосредованного Cell (ММК), антигены должны быть идентифицированы, которые производят не только достаточное число ответ Т-клеток, но и функционально надежный ответ Т-клеток. Здесь мы оцениваем процентов ячейке конкретных убийство двух пептидных специфических Т клеточных клонов в BALB / с мышами.
Protocol
Discussion
Этот анализ может быть изменен, чтобы исследовать способность к пролиферации клеток, в том числе клональной экспансии, потому что CFSE делится поровну между относительно потомства 10,11. Кроме того, можно использовать CFSE маркировки для расследования миграции клеток 6,12, хотя Ес?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Я хотел бы поблагодарить Бьянка Мот, Карла Oseroff, и Мари-Франс DelGuercio для введения мне иммунологических анализов и мышь обработки. Работа в лаборатории Г. А. Splitter финансируется за счет гранта NIH 1-RO1-AI-073558, GLRCE грант 1-U54-AI-057153, а BARD американо-3829-06.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | ||
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | ||
| 96-well plate | Costar | 3799 | ||
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | ||
| DMSO | Sigma | D-5879 | ||
| FBS | GIBCO | 16000-077 | ||
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | n/a | ||
| Kontes glass tissue grinder | Kontes | 885300-0015 | ||
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | ||
| Needle | B-D | 305175 | ||
| Parafilm “M” | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | ||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | ||
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | ||
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-093 | ||
| Syringe | B-D | 309602 | ||
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen (Molecular Probes) | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .
