De nombreuses infections provoquent une forte réponse CTL, mais parfois, la quantité de cellules répondant n'est pas en corrélation au contrôle de l'agent pathogène 1. Une mesure de la qualité de CTL est leur capacité à tuer spécifiquement 2. CFSE étiquetage des cellules cibles peuvent être utilisées pour enquêter sur cette qualité réponse CTL In vivo 3,4.
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Article de méthode
Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée
Dans cet article
Résumé
Résumé
Carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) peut être utilisé facilement et rapidement l'étiquette d'une population cellulaire d'intérêt pour l'enquête in vivo. Cet étiquetage a été classiquement utilisé pour étudier la prolifération et la migration. Dans la méthode présentée ici, nous avons raccourci les délais, après le transfert adoptif de regarder la survie et la mort de cellules CFSE épitope spécifique cible marquée 4-6. Le niveau de destruction spécifique d'un clone cellulaire T CD8 + peuvent indiquer la qualité de la réponse, que leur quantité peut être trompeur. Spécifiques cellules T CD8 + peuvent devenir fonctionnellement épuisées au cours du temps avec une baisse de la production de cytokines et de tuer 7,8. En outre, certains clones CD8 + des lymphocytes T ne peut pas tuer ainsi que d'autres avec différentes spécificités TCR 9. Pour immunité à médiation cellulaire efficace (CMI), les antigènes doivent être identifiés qui produisent non seulement un nombre suffisant de répondre cellules T, mais aussi fonctionnellement robustes cellules T répondant. Ici nous évaluons la destruction des cellules spécifiques de deux pour cent peptide spécifique des clones de lymphocytes T dans souris Balb / c.
Protocole
1. Solliciter la cible des CTL spécifiques effectrices par la vaccination (jour 0)
- Avant de commencer, décider d'un effecteur spécifique: le système cible. Dans cet exemple d'un classique in vivo de CTL dosage, nous allons utiliser une vaccination peptide purifié à susciter spécifiques des cellules T CD8 +. Le même peptide sera utilisé pour les cellules cibles d'impulsion syngéniques, la création d'un effecteur spécifique: le système cible. Alternativement, vous pouvez choisir d'utiliser tout ou protéines pathogènes pour obtenir votre effecteurs et cibles spécifiques.
- Décontaminer la surface de travail à l'intérieur d'un capot de biosécu....
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Discussion
Ce dosage peut être modifié pour enquêter sur la capacité proliférative des cellules, y compris l'expansion clonale, parce CFSE divise de façon relativement égale parmi les descendants 10,11. Il est également possible d'utiliser l'étiquetage CFSE pour enquêter 6,12 migration cellulaire, mais il existe d'autres cellules de traçage des méthodes qui peuvent être plus appropriés en fonction de votre hypothèse, pour les tétramères exemple et bioluminescence 13, qui peut égalem.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré. Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) à l'Université de Wisconsin-Madison.
Remerciements
Je tiens à remercier Bianca Mothe, Carla Oseroff, et Marie-France DelGuercio pour me présenter à des tests immunologiques et de manipulation de la souris. Le travail dans le laboratoire de GA Splitter est financé par les NIH-RO1 subvention de 1-AI-073 558, GLRCE subvention de 1-U54-AI-057 153, et Bard US-3829-06.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Billes de verre de 1 mm | Biospec Products | 11079110 | |
| Filtre cellulaire de 70 μm | BD Biosciences | 352350 | |
| Plaque de 96 puits | Costar | 3799 | |
| Adjuvant d'Incomplete Freund’s Adjulite | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| Sérum bovin fœtal (FBS) | GIBCO, par Life Technologies | 16000-077 | |
| Cytomètre en flux FC 500 | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Moulin à tissus en verre Kontes | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini broyeur à billes | Biospec Products | n/a | |
| Aiguille | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldéhyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, par Life Technologies | 10010-023 | |
| Réactif de lyse PharmLyse | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, par Life Technologies | 11875-093 | |
| Seringue | BD Biosciences | 309602 | |
| Kit Vybrant CFSE | Invitrogen | V12883 |
Références
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M.
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Réimpressions et autorisations
