Antigenspecifikt In Vivo Killing analysen med CFSE Märkta målceller
Summary
Många infektioner framkalla ett starkt CTL svar, men ibland, inte mängden svarar cellerna inte korrelerar till kontroll av den sjukdomsalstrande<sup> 1</sup>. Ett mått på CTL kvalitet är deras förmåga att döda specifikt<sup> 2</sup>. CFSE märkning av målceller kan användas för att undersöka CTL svar kvalitet<em> In vivo</em<sup> 3,4</sup>.
Abstract
Carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFSE) kan användas för att enkelt och snabbt märka en cellpopulationen för in vivo utredning. Denna märkning har klassiskt använts för att studera spridning och migration. I den metod som presenteras här har vi förkortat tidslinjen efter adoptiv transfer för att titta på överlevnad och dödandet av epitop specifika märkta celler CFSE mål 4-6. Nivån av specifika dödandet av ett CD8 + T-cell klon kan indikera kvaliteten på svaret, eftersom deras kvantitet får vara vilseledande. Särskilda CD8 + T celler kan bli funktionellt utmattad över tiden med en nedgång i cytokinproduktionen och dödar 7,8. Dessutom kan vissa CD8 + T cells kloner dödar inte lika bra som andra med olika TCR särdrag 9. För effektiv cellmedierad immunitet (CMI), måste antigen identifieras som producerar inte bara tillräckligt många svarar T-celler, men också funktionellt robust svarar celler T. Här har vi utvärdera procent cellspecifik dödandet av två peptid specifika kloner T-cell i BALB / c möss.
Protocol
Discussion
Denna analys kan modifieras för att undersöka proliferativ kapacitet i celler, inklusive klonal expansion, eftersom CFSE delar relativt lika mellan avkomma 10,11. Det är också möjligt att använda CFSE märkning för att undersöka cell migration 6,12, men det finns andra celler spåra metoder som kan vara mer lämpliga beroende på din hypotes, exempelvis tetramers och mareld 13, som också kan kombineras med CFSE märkning.
Det är viktigt att notera a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jag vill tacka Bianca Mothe, Carla Oseroff, och Marie-France DelGuercio för att införa mig att immunologiska analyser och mus hantering. Arbetet i labbet GA Splitter finansieras av NIH bevilja 1-RO1-AI-073.558, GLRCE bevilja 1-U54-AI-057.153, and Bard USA-3829-06.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | ||
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | ||
| 96-well plate | Costar | 3799 | ||
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | ||
| DMSO | Sigma | D-5879 | ||
| FBS | GIBCO | 16000-077 | ||
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | n/a | ||
| Kontes glass tissue grinder | Kontes | 885300-0015 | ||
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | ||
| Needle | B-D | 305175 | ||
| Parafilm “M” | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | ||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | ||
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | ||
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-093 | ||
| Syringe | B-D | 309602 | ||
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen (Molecular Probes) | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .
