Summary

Antigen-spezifische In Vivo Killing-Assay mit CFSE markierten Zielzellen

Published: November 09, 2010
doi:

Summary

Viele Infektionen auslösen eine starke CTL-Antwort, aber gelegentlich, die Menge der reagierenden Zellen nicht korrelieren mit der Bekämpfung von Krankheitserregern,<sup> 1</sup>. Ein Maß für CTL Qualität ist ihre Fähigkeit, spezifisch abtöten<sup> 2</sup>. CFSE Markierung von Zielzellen kann verwendet werden, um diese CTL-Antwort Qualität zu untersuchen<em> In vivo</em<sup> 3,4</sup>.

Abstract

Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) können verwendet werden, um einfach und schnell Etikett einer Zellpopulation von Interesse für die in vivo Untersuchung. Diese Kennzeichnung ist klassisch benutzt worden, um die Proliferation und Migration zu studieren. In dem hier vorgestellten Verfahren haben wir die Zeitachse nach adoptiven Transfer auf das Überleben und die Tötung von Epitop-spezifischen CFSE markierten Zielzellen 4-6 aussehen verkürzt. Die Höhe der spezifischen Tötung eines CD8 + T-Zell-Klon kann zeigen die Qualität der Antwort, da ihre Menge kann irreführend sein. Spezifischen CD8 + T-Zellen können sich funktionell erschöpft im Laufe der Zeit mit einem Rückgang der Produktion von Zytokinen und Töten 7,8. Auch können bestimmte CD8 + T-Zell-Klonen nicht so gut wie andere zu töten mit unterschiedlichen TCR Besonderheiten 9. Für eine effektive zellvermittelte Immunität (CMI), muss Antigene identifiziert, die produzieren nicht nur eine ausreichende Anzahl von T-Zellen reagieren, sondern auch funktionell robust reagieren T-Zellen. Hier bewerten wir die Prozent-Zell-spezifische Tötung von zwei Peptid-spezifischen T-Zell-Klone in BALB / c Mäusen.

Protocol

1. Hervorrufen Target-spezifische Effektor CTLs durch Immunisierung (Tag 0) Zielsystem: Bevor Sie beginnen, auf eine spezifische Effektor entscheiden. In diesem Beispiel einer klassischen in vivo CTL-Assay verwenden wir ein gereinigtes Peptidimmunisierung spezifische CD8 + T-Zellen auslösen. Das gleiche Peptid wird verwendet, um den syngenen Zielzellen Puls, die Schaffung einer spezifischen Effektor: Target-System. Alternativ können Sie wählen, um ganze Erreger oder Protein benutzen, um Ihre spezi…

Discussion

Dieser Test kann geändert werden, um die proliferative Kapazität von Zellen, einschließlich klonale Expansion untersucht werden, weil CFSE teilt relativ gleichmäßig auf Nachkommenschaft 10,11. Es ist auch möglich, CFSE Kennzeichnung zu verwenden, um die Zellwanderung 6,12 untersuchen, obwohl es andere Zelle Tracing-Verfahren, die besser geeignet sein kann je nach Hypothese, z. B. Tetramere und Biolumineszenz 13, die ebenfalls mit CFSE Kennzeichnung kombiniert werden kann.

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Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ich möchte Bianca Mothe, Carla Oseroff und Marie-France DelGuercio für ihre Einführung in immunologischen Assays und Maus Umgang danken. Die Arbeit im Labor von GA Splitter wird von NIH 1-RO1-AI-073558, GLRCE gewähren 1-U54-AI-057153, und BARD US-3829-06 finanziert.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
1 mm glass beads   Biospec Products 11079110  
70 μm cell strainer   BD Falcon 352350  
96-well plate   Costar 3799  
Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant   Pacific Immunology n/a  
DMSO   Sigma D-5879  
FBS   GIBCO 16000-077  
FC 500 Flow Cytometer   Beckman Coulter n/a  
Kontes glass tissue grinder   Kontes 885300-0015  
Mini Beadbeater   Biospec Products n/a  
Needle   B-D 305175  
Parafilm “M”   Pechiney Plastic Packaging PM992  
Paraformaldehyde   Electron Microscopy Sciences 157-8  
PBS   GIBCO 10010-023  
PharmLyse lysing reagent   BD Biosciences 555899  
RPMI 1640   GIBCO 11875-093  
Syringe   B-D 309602  
Vybrant CFSE Kit   Invitrogen (Molecular Probes) V12883  

References

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Citer Cet Article
Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells. J. Vis. Exp. (45), e2250, doi:10.3791/2250 (2010).

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