Ici, nous décrivons un protocole pour l'isolement et la culture de cellules endothéliales murines pulmonaires. Cette méthode comprend mécanicien et dissociation enzymatique du tissu pulmonaire ainsi que d'un processus de purification en 2 étapes utilisant des anticorps anti-PECAM-1 et anti-ICAM-2 anticorps conjugués à des billes magnétiques, ce qui produit une population de cellules endothéliales pures d'origine essentiellement microvasculaires.
Les cellules endothéliales de fournir un modèle de recherche utiles dans de nombreux domaines de la biologie vasculaire. Depuis son premier isolement 1, des cellules endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) ont montré pour être pratique, facile à obtenir et à la culture, et sont donc les cellules endothéliales plus largement étudié. Cependant, pour des recherches axées sur les processus de l'angiogenèse comme les autres, la perméabilité ou plusieurs cellules endothéliales microvasculaires (ECs) sont un modèle beaucoup plus physiologiquement pertinents pour l'étude 2. Par ailleurs, EC isolées de souris knockout fournir un outil utile pour l'analyse des protéines ex vivo la fonction. Plusieurs approches d'isoler et de la culture microvasculaires ECs de différentes origines ont été rapportés à ce jour 3-7, mais l'isolement et la culture cohérente de pure ECS est toujours un problème technique majeur dans de nombreux laboratoires. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape sur une méthode fiable et relativement simple d'isoler et de cultiver des cellules de souris pulmonaires endothéliales (MLECs). Dans cette approche, les tissus pulmonaires obtenues à partir de 6 – 8 jours chiots ancienne est d'abord coupé en morceaux, digérés par la collagénase / dispase (C / D) en solution et dispersés mécaniquement dans une seule cellule de suspension. MLECS sont purifiés à partir de cellules en suspension en utilisant une sélection positive avec des anti-PECAM-1 anticorps conjugué à Dynabeads utilisant un concentrateur de particules magnétiques (MPC). Ces cellules purifiées sont cultivées sur la culture de tissus enduits de gélatine (TC) plats jusqu'à ce qu'ils deviennent confluentes. A ce stade, les cellules sont encore purifiée en utilisant Dynabeads couplé à l'anti-ICAM-2 anticorps. MLECs obtenus avec ce protocole présentent un phénotype pavées, comme visualisé par microscopie optique à contraste de phase, et leur phénotype endothélial a été confirmée en utilisant une analyse FACS avec des anti-VE-cadhérine 8 et anti-VEGFR2 9 anticorps et coloration par immunofluorescence de la VE-cadhérine. Dans nos mains, cette procédure d'isolement en deux étapes cohérente et fiable des rendements d'une population pure de MLECs, qui peut encore être cultivé. Cette méthode permettra aux chercheurs de profiter du nombre croissant de knock-out et des souris transgéniques pour une corrélation directe entre les études in vivo avec des résultats d'expériences de vitro réalisées sur MLECs isolées et contribuer ainsi à révéler des mécanismes moléculaires des phénotypes vasculaires observés de vivo.
Microvasculaire EC se sont révélés être un modèle utile dans de nombreux domaines de la biologie vasculaire et sont considérés comme physiologiquement plus pertinent d'étudier (par exemple l'angiogenèse) que largement étudié HUVEC 3. Auparavant, il a été rapporté que microvasculaires ECS peut être obtenu à partir de rein, cœur, peau de tissu adipeux, la rétine, le cerveau, le gliome, et aussi des poumons 2, 4-7, 10, 11. Toutefois, une méthode cohérente et fiable pour l'isolement des complications microvasculaires ECS est toujours requis. La procédure présentée ici est une modification d'un protocole de deux publiés antérieurement; elle diffère de la plupart des procédures publiées en ce qu'elle utilise les chiots au lieu d'animaux adultes. Ceci est crucial pour le succès d'isolement que les cellules de jeunes animaux ont un potentiel élevé de prolifération et de cultures dérivées de leurs tissus ont tendance à donner plus grand nombre de cellules. Une semaine anciens animaux semblent être optimales mais les jeunes souris (quatre jours d'âge) peuvent également être utilisés. En outre, nombre supérieur ou inférieur de chiots peut être utilisée si nécessaire, comme nous avons réussi à isoler MLECs d'un chiot. Cependant, tout en réduisant le haut ou vers le bas le processus d'isolement, densité de placage cellulaire doit rester inchangée, comme cela est également critique pour la prolifération cellulaire. Le processus de purification en 2 étapes du MLECs utilisant des billes magnétiques conjuguées premier anti-PECAM-1 et que les anti-ICAM-2 anticorps est beaucoup plus efficace d'obtenir des cultures pures de CE que les procédures décrites précédemment de purification en une seule étape. Ce protocole élimine la nécessité d'utiliser des techniques manuelles très laborieux, la centrifugation de gradient et FACS moins efficace de tri des cellules jeter polluants tels que les fibroblastes, les cellules sanguines et des cellules musculaires lisses. La population résultant MLEC peut être utilisé pour l'analyse de vitro des réponses angiogéniques, la perméabilité vasculaire et la transmigration des leucocytes, la cicatrisation des plaies ainsi que l'analyse biochimique des voies de signalisation. Si nécessaire, MLECs peuvent être plaqués sur différentes surfaces telles que des lamelles de fibronectine ou de la gélatine à revêtement pour les tableaux immunofluorescence ou d'électrodes pour la résistance trans-endothéliale (TER) mesures. Les résultats obtenus peuvent être comparés directement aux phénotypes observés de vivo, ce qui est particulièrement important dans le contexte de l'augmentation du nombre des huitièmes de finale et de lignées de souris transgéniques. Mise en œuvre réussie de cette méthode pour l'analyse de vitro des mécanismes cellulaires qui sous-tendent les défauts observés de vivo, a déjà été présentée 12.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été financée en partie par l'American Heart Association 0950118G.to octroi MC-W.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | ||
forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | ||
14G cannula | Fisher | 1482516N | ||
20 ml syringe | BD | 309661 | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | ||
anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | ||
Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | ||
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Pharmingen | 553369 | ||
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Pharmingen | 553326 | ||
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Applied Science | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C | |
DMEM | Cellgro Mediatech | 10-013-CV | ||
Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | ||
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | ||
0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-052-CI | ||
Cell strainer 70 μm nylon | Falcon | 352350 | ||
tissue culture flask 75 cm2 | TPP | 90076 |