Здесь мы опишем протокол для изоляции и культуре мышиных легочных эндотелиальных клеток. Этот метод включает в себя механические и ферментативной диссоциации легочной ткани, а также 2-х ступенчатый процесс очистки с использованием анти-PECAM-1 и анти-ICAM-2 антител, конъюгированных с магнитных бус, который производит чистый эндотелиальной клеточной популяции в основном микрососудистых происхождения.
Эндотелиальная клетки обеспечивают полезную модель исследования во многих областях сосудистой биологии. С момента своего первого изоляции 1, пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs) показали, чтобы быть удобной, легко получить и культуры, и, следовательно, являются наиболее широко изучается эндотелиальных клеток. Однако, для исследований, направленных на процессы, как ангиогенез, проницаемость и многие другие, микрососудистых эндотелиальных клеток (ECS) являются гораздо более физиологически соответствующие модели для изучения 2. Кроме того, ECS изолированы от нокаутом мышей стать полезным инструментом для анализа белков естественных бывшие функции. Несколько подходов, чтобы изолировать и культуры микрососудистых исполкомов различного происхождения были зарегистрированы на сегодняшний день 3-7, но в соответствии изоляции и культуры чистой этике до сих пор основные технические проблемы во многих лабораториях. Здесь мы предоставляем шаг за шагом, протокол о надежных и относительно простой метод выделения и культивирования мыши легких эндотелиальных клеток (MLECs). При таком подходе, легкие ткани, полученной от 6 – до 8-дневных щенков сначала разрезают на куски, расщепляют коллагеназа / dispase (C / D) решение и разошлись механически в одной клеточной суспензии. MLECS очищают от клеточной суспензии с использованием позитивного выбора с анти-PECAM-1 антител, конъюгированных с Dynabeads использованием магнитных частиц Концентратор (ПДК). Такие очищенные клетки культивируют на желатин покрытием культуре ткани (ТС) блюда, пока они не сливающийся. В этот момент клетки дополнительно очищают использованием Dynabeads связан с анти-ICAM-2 антител. MLECs, полученные с применением протокола выставку булыжником фенотип, как визуализируются с помощью фазово-контрастной световой микроскопии, а также их эндотелия фенотип была подтверждена с помощью анализа FACS с анти-VE-кадгерина 8 и анти-VEGFR2 9 антител и иммунофлуоресцентного окрашивания VE-кадгерина. В наших руках, это двухступенчатая процедура изоляции последовательно и надежно дает чистый населения MLECs, которые могут быть дополнительно культурно. Этот метод позволит исследователям, чтобы воспользоваться растущим числом нокаутом и трансгенных мышах, чтобы прямо коррелируют в естественных условиях исследования с результатами в пробирке эксперименты на изолированных MLECs и тем самым помогают выявить молекулярные механизмы сосудистой фенотипы наблюдается в естественных условиях.
Микрососудистой этике доказали свою полезную модель во многих областях сосудистой биологии и, как считается, более физиологически, имеющие отношение к работе (например, ангиогенез), чем широко изучается HUVECs 3. Ранее сообщалось, что микрососудистых этике могут быть получены из почек, сердца, кожи, сетчатки глаза, мозга, глиомы, жировой ткани, а также 2 легких, 4-7, 10, 11. Тем не менее, последовательным и надежным методом для изоляции микрососудистых этике все еще требуется. Процедура, представленная здесь, модификацию ранее опубликованных протоколов 2, она отличается от большинства опубликованных процедур в том, что он использует щенков, а не взрослых животных. Это очень важно для изоляции успех как клетки от молодых животных, имеют более высокий потенциал и распространения культуры, связанных с их ткани, как правило, дают более высокие количества клеток. Неделю старых животных кажутся оптимальными, но молодых мышей (4 дня от роду) также может быть использован. Кроме того, больше или меньше количества щенков можно использовать, если требуется, так как мы добились успеха в изоляции MLECs от одного щенка. Однако, несмотря на повышение или понижение изоляции процессов, клеточной плотности покрытия должны остаться неизменными, так как это также имеет важное значение для клеточной пролиферации. 2-х ступенчатый очистке MLECs использованием магнитных шариков сопряженных первым анти-PECAM-1 и чем анти-ICAM-2 антител является гораздо более эффективным при получении чистых культур ЕС, чем ранее описанные пошагово процедуры очистки. Этот протокол избавляет от необходимости использовать очень кропотливой ручной техники, градиент центрифугирования и менее эффективных FACS сортировки для отбрасывания загрязняющих клетки, такие как фибробласты, клетки крови и клетки гладкой мускулатуры. В результате ТЗЭТ населения могут быть использованы для экстракорпорального анализ ангиогенных ответов, проницаемости сосудов и лейкоцитов переселения, заживление ран, а также биохимический анализ сигнальных путей. При необходимости может быть MLECs покрытием на различных поверхностях, таких как фибронектин или желатин покрытием покровные для иммунофлюоресценции или электрод массивы для транс-эндотелиальной сопротивления (TER) измерений. Полученные результаты могут быть непосредственно по сравнению с фенотипами наблюдается в естественных условиях, что особенно важно в контексте растущего числа нокаутом и трансгенных линий мышей. Успешная реализация данного метода для лабораторного анализа клеточных механизмов, лежащих дефектов наблюдается в естественных условиях, уже был представлен 12.
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Американской ассоциации сердца грант 0950118G.to MC-З.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | ||
forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | ||
14G cannula | Fisher | 1482516N | ||
20 ml syringe | BD | 309661 | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | ||
anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | ||
Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | ||
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Pharmingen | 553369 | ||
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Pharmingen | 553326 | ||
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Applied Science | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C | |
DMEM | Cellgro Mediatech | 10-013-CV | ||
Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | ||
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | ||
0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-052-CI | ||
Cell strainer 70 μm nylon | Falcon | 352350 | ||
tissue culture flask 75 cm2 | TPP | 90076 |