Aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de Percoll
Summary
El presente artículo describe un protocolo rápido para aislar eficazmente células mononucleares de tejidos de la médula espinal y el cerebro que puede ser efectivamente utilizado para el análisis de citometría de flujo.
Abstract
El aislamiento de las células inmunes que se infiltran en el sistema nervioso central (SNC) durante la infección, traumatismo, enfermedades autoinmunes o la neurodegeneración, es a menudo necesaria para definir su fenotipo y funciones efectoras. Métodos histoquímicos son fundamentales para determinar la ubicación de la infiltración de las células y para analizar el sistema nervioso central patología asociada. Sin embargo, in-situ histoquímica y técnicas de inmunofluorescencia tinción se ven limitados por el número de anticuerpos que se pueden utilizar en un momento único para caracterizar los subtipos de células inmunes en un determinado tejido. Por lo tanto, los enfoques histológicos en relación con el fenotipo inmunológico por citometría de flujo son fundamentales para caracterizar la composición de la infiltración del SNC local. Este protocolo se basa en la separación de suspensiones celulares del SNC más discontinuo gradientes de Percoll. El presente artículo describe un protocolo rápido para aislar eficazmente células mononucleares de tejidos de la médula espinal y el cerebro que puede ser efectivamente utilizada para la identificación de las diferentes poblaciones de células inmunes en una sola muestra por citometría de flujo.
Protocol
Discussion
Los análisis de marcadores de superficie celular en los leucocitos del SNC de los tejidos normales de ratón y se inflama se ha utilizado por décadas varios 1.3. Protocolos de aislamiento se basan en la separación de la microglía y leucocitos por cuatro densidad de centrifugación. Aquí se describe un método rápido y eficaz de aislar a los leucocitos del SNC con gradientes de Percoll discontinua. Después del aislamiento de las células, tinción con anticuerpos diferentes, tales como, pero …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T para AEC) y la Universidad de Texas en San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
- Percoll (Amersham)
- 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
- RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
- 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
- Cell Staining Buffer (Biolegend)
- Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
- 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
- Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
- Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)
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