Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen
Summary
Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.
Abstract
De eerste stappen in gewervelde visie plaats te vinden wanneer het licht stimuleert de staafjes en kegeltjes fotoreceptoren van het netvlies 1. Deze informatie wordt vervolgens gescheiden in wat bekend staat als de ON en OFF paden. De fotoreceptoren signaal licht informatie naar de bipolaire cellen (BCS), die depolariseren in reactie op toe (On BCS) of afneemt (Uit BCS) in lichtintensiteit. Deze scheiding van het licht informatie wordt gehandhaafd op het niveau van de retinale ganglioncellen (RGC), die dendrieten stratificatie in ofwel de Off sublamina van de binnenste plexiform laag (IPL), waar ze direct excitatoire input van Off BC's hebben, of stratificatie in Op de sublamina van het IPL, waar ze direct excitatoire input van On BCS. Deze scheiding van informatie met betrekking tot stijgingen of dalingen in verlichting (de aan-en uitzetten pathways) is geconserveerd en gesignaleerd naar de hersenen in parallel.
De RGC is de output cellen van het netvlies, en zijn dus een belangrijke cel te bestuderen om te begrijpen hoe licht informatie wordt gesignaleerd aan visuele kernen in de hersenen. Vooruitgang in de muis genetica afgelopen decennia hebben geleid tot een verscheidenheid van fluorescerende reporter muis lijnen waar specifieke RGC populaties zijn gelabeld met een fluorescerend eiwit, zodat voor de identificatie van RGC subtypes 2 3 4 en specifieke targeting voor elektrofysiologische opname. Hier presenteren we een methode voor het opnemen van lichte reacties van fluorescent gelabelde ganglion cellen in een intact, geïsoleerde netvlies voorbereiding. Deze geïsoleerde netvlies voorbereiding zorgt voor opnamen van RGC, waar de dendritische prieel is intact en de ingangen in de gehele RGC dendritische prieel worden bewaard. Deze methode is van toepassing in een verscheidenheid van ganglion cel subtypes en vatbaar is voor een breed scala van single-cell fysiologische technieken.
Protocol
Discussion
Deze techniek is toepasbaar op elk retinale ganglion cel opnamen uit een geïsoleerde netvlies. Hoewel in de muis lijn hierboven gebruikte intrinsiek lichtgevoelige, melanopsine expressie RGC zijn gelabeld met EGFP 2, 5, dit protocol is gemakkelijk overdraagbaar naar andere fluorescent gelabelde RGC lijnen of kan worden gegeneraliseerd naar opnemen van willekeurig geselecteerde RGC ook. Deze techniek is bijzonder waardevol omdat de dendritische prieel van elk RGC en haar respectieve inbreng neuronen worden ge…
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Wij danken Darwin Hang voor zijn technische bijstand.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ames’ Medium | Sigma | A1420 | ||
| Collagenase | Whorthington Biochemical | LS005273 | ||
| Hyaluronidase | Whorthington Biochemical | LS002592 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | ||
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | ||
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | ||
| Electrodes | Sutter Instruments | BF120-69-10 | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | ||
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | ||
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
- Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).
- Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development. J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).
- Huberman, A. D. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62, 327-334 (2009).
- Siegert, S. Genetic address book for retinal cell types. Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29, 476-482 (2009).
- Newman, E. A., Bartosch, R. An eyecup preparation for the rat and mouse. J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neurosciences. 160, 126-139 (2009).
- Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision. J Neurosci. 27, 692-699 (2007).
- Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination. J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).
- Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina. Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).
