Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen
Summary
Ein effizientes System der Struktur-und Funktionsanalyse eines Gens in einer<em> Ex vivo</em> Kultur der Milz B-Lymphozyten beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der rekombinanten retroviralen Produktion in ein Helfer frei, ecotrophic Verpackungs-Zelllinie. Stabile, vererbbare Expression eines Gens von Interesse innerhalb des primären Lymphozyten erreicht, was zu Generation Oberfläche Antikörper auf B-Zellen durchlaufen Klasse wechseln Rekombination.
Abstract
Die transgenen Expression von Genen in eukaryotischen Zellen ist ein leistungsfähiges reverse genetische Ansatz, bei dem ein Gen von Interesse unter der Kontrolle eines heterologen Expressionssystem exprimiert wird, um die Analyse der resultierenden Phänotyp zu erleichtern. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um ein Gen, das normalerweise nicht in den Organismus gefunden auszudrücken, um eine mutierte Form des Gens Produkt zum Ausdruck bringen, oder zu überexprimieren eine dominant-negative Form des Genprodukts werden. Es ist besonders nützlich in der Studie des hämatopoetischen Systems, wo Transkriptionsregulation ist ein wichtiger Kontrollmechanismus in der Entwicklung und Differenzierung von B-Zellen 1, de 2-4 überprüft.
Mausgenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Erforschung der menschlichen Gene und Krankheiten. Eine vergleichende Analyse der Maus und menschlichen Genoms offenbart Erhaltung der Syntenie in mehr als 90% des Genoms 5. Außerdem ist ein Großteil der Technologie in Maus-Modellen verwendet werden für das Studium der menschlichen Gene, zum Beispiel Gendisruptionen und allelische Austausch 6 . Allerdings erfordert die Schaffung einer transgenen Maus ein hohes Maß an Ressourcen sowohl eine finanzielle und technische Natur. Mehrere Projekte wurden begonnen, um Bibliotheken von Knock-out-Maus-Stämme (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) oder Mutagenese induzierte Belastungen (RIKEN), die großen Anstrengungen und Zusammenarbeit 7 erfordern kompilieren. Daher ist es wünschenswert, erste Studie der Phänotyp eines gewünschten Gens in einer Zellkultur-Modell von primären Zellen vor fortschreitend bis zu einem Mausmodell.
Retrovirale DNA integriert in die Wirts-DNA, vorzugsweise innerhalb oder in der Nähe Transkription Einheiten oder CpG-Inseln, die sich in stabilen und vererbbar Ausdruck des verpackten Gen von Interesse unter Vermeidung transkriptionellen Silencing 8 9. Die Gene werden dann unter der Kontrolle von einem hohen Wirkungsgrad retroviralen Promotor transkribiert, was zu einer hohen Effizienz der Transkription und Protein-Produktion. Daher kann retroviralen Expressionsvektor mit Zellen, die schwer zu transfizieren sind, verwendet werden, sofern die Zellen in einen aktiven Zustand während der Mitose. Da die strukturellen Gene des Virus innerhalb der Verpackungs-Zelllinie enthalten sind, enthalten die Expressionsvektoren verwendet werden, um das Gen von Interesse Klon keine strukturellen Gene des Virus, das sowohl die Möglichkeit der viralen Revertanten beseitigt und erhöht die Sicherheit bei der Arbeit mit viralen Überständen da keine infektiösen Virionen sind 10 hergestellt.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die rekombinante retrovirale Produktion und nachfolgende Infektion von Milz-B-Zellen. Nach der Isolierung werden die kultivierten Milzzellen mit Th abgeleitet Lymphokine und anti-CD40, die einen Ausbruch von B-Zell-Proliferation und Differenzierung 11 induziert stimuliert. Dieses Protokoll ist ideal für die Untersuchung der Ereignisse am späten B-Zell-Entwicklung und Differenzierung, wie B-Zellen aus der Milz nach der ersten hämatopoetischen Ereignisse, sondern vor antigenen Stimulation plasmazelluläre Differenzierung induzieren isoliert sind.
Protocol
Discussion
Retrovirale Transduktion von Milz-B-Zellen, wie hier beschrieben und wie abgebildet in Abbildung 1 ist eine genetische Ansatz, die nützlich bei der Untersuchung der B-Lymphozyten ist, weil viele der Entwicklungs-Veranstaltungen in lymphopoesis durch Regulation der Transkription 1, 2 gesteuert werden. In den späteren Stadien der B-Zell-Reifung, Triggerung über CD40L ist essentiell für die Induktion der B-Zell-Wachstum, Eintritt in den Zellzyklus und Proliferation 11, 20. Wie in …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CK wird von der Columbia University Graduate-Programm unterstützt. UB ist Fellow der Leukemia and Lymphoma Society of America, die Empfänger von New Investigator Award der Leukämie Research Foundation und wird von der Columbia University New Faculty Anschubfinanzierung unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
References
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. . Introduction to Genetic Analysis. , (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
