이 프로토콜은 electroporation과 문화 마우스 hippocampal 및 대뇌 피질의 뉴런을 통해 transfect, 해부하다하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 장기 문화가 synaptogenesis 및 돌기 척추 분석 연구에 사용할 수 있지만 단기 문화는 축삭의 파생물과지도의 연구에 사용할 수 있습니다.
Hippocampal과 대뇌 피질의 뉴런은 중추 신경계 (CNS)의 연결을 편광, 축삭 / dendrite 파생물 및 버렸네 형성과 기능을 연구하기 위해 널리 사용되었습니다. culturing 이러한 뉴런의 장점들은 쉽게 매우 낮은 밀도에서 2 차원 기판에 특유의 axons과 dendrites을 형성, 분극이다. 이 속성은의 연결을 개발의 여러 측면을 결정을 위해 매우 유용하게되었다. 또한, 이러한 뉴런에 glial 컨디셔닝을 제공하여 그들이 기능 시냅스 연결을 형성하고 문화에 몇 개월 동안 생존 개발 나갈 것입니다. 이 프로토콜에서 우리는 해부하다하는 기술, 문화, transfect 배아 마우스 hippocampal과 대뇌 피질의 뉴런을 설명합니다. Transfection은 nucleofection 통해 도금 전에 뉴런에 DNA를 electroporating에 의해 수행됩니다. 이 프로토콜은 분극, 축삭의 가지와 분기 동안 단백질의 역학과 기능을 연구 개발 (~ 4 8hrs 도금 후) 초기에 찬란 – 태그 융합 단백질을 표현하는 장점이 있습니다. 또한 도금 전에 하나의 transfection은 신경 세포 (문화> 2 개월)의 수명에 걸쳐 이미징에 적합한 수준에서 찬란 – 태그 융합 단백질 발현을 유지 것을 발견했습니다. 따라서,이 방법론의 연결 기능을 거의 또는 전혀 방해와 CNS 개발 전반에 걸쳐 단백질 현지화 및 기능을 공부하는 데 유용합니다.
culturing 배아 hippocampal 및 대뇌 피질의 마우스 뉴런에이 프로토콜은 쥐 신경 1,2을 사용 뱅커 프로토콜의 변경으로 개발되었습니다. 우리는 잘 3,4,5,6,7로 culturing 마우스와 햄스터 뉴런에이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 이 프로토콜은 hippocampal과 neocortical 두 뉴런에 동일하게 잘 작동하고 Meberg와 밀러 8 시까지 출판 프로토콜과 유사합니다. 그들이 잘 특징과 더 설립 모델 시스템이기 때문에 일반적으로, 우리는 장기적인 문화 hippocampal 뉴런을 사용합니다. 또한, 그들은 네크로 텍스 이상의 뉴런보다 균일한 인구를 포함할 가능성이 높습니다. 그러나, neocortical 뉴런은 생존과 (되지 않은 데이터) 마찬가지로 차별이 프로토콜을 사용하는 양식. 우리는 일상적으로 단기 문화 hippocampal과 neocortical 뉴런을 사용합니다. 네크로 텍스의 절개는 또한 서양 예를 들어, 모래 바닥에 대한 자료를 더 나은 선택하게 hippocampal 해부 (hippocampi의 쌍 당 2.5×10 5 뉴런)보다 실질적으로 더 많은 뉴런 (cortices의 쌍 당 1.5×10 6 뉴런)의 결과.
어떤 차 문화와 마찬가지로, 그것은 동물의 죽음에서 세포의 도금을하는 데 걸리는 시간을 최소화하는 것이 필수적입니다. 그것은 일반적으로 절개하고 도금에서 일관 빠른 될 10-20 해부를 취할 것입니다. 그들이 nucleofection 버퍼에 남아있는 경우 뉴런의 생존이 빠르게 감소로 또한, Lonza Nucleofector 작업을 할 때, 그것은, electroporation 과정에서 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.
대부분의 이미징의는 총 내부 반사율의 형광 현미경 (TIRFM)에 실시됩니다. 현미경 이런 유형의 coverslip 넘어 이미징 수백 나노미터에 불과 가능합니다. 따라서, 우리는 자주 이미지, axonal 성장 원뿔과 돌기의 쪽이은 coverslip에 직접 준수하는 뉴런의 영역을 필요. 따라서, 우리는 장기적인 문화 glial 먹이를 필요로 저밀도 문화를 사용합니다. 우리는 장기적인 문화, glial 피더 레이어없이 (> 2×10 4 셀 / cm 2) 높은 밀도 문화를 사용하고 그들이 약간의 먹이로 잘 살아남을 것으로 나타났습니다. 그들이 쉽게 와이드 필드 현미경이나 공촛점 현미경과 함께 발견 될 수 있지만 그러나 이러한 뉴런의 돌기 쪽이은 자주 너무 멀리 기판에서 TIRFM의 이미지입니다.
우리의 연구의 대부분 우리는 도금 전에 신경을 transfect, 최대 문화에 3 개월에 대한 찬란 – 표시된 단백질을 몇 군데있다. 찬란 – 분류 단백질의 장기 표현은 DNA (1 2μg)의 낮은 농도를 사용하여 우리는 뉴런에서 overexpression 유물을 생산하지 않는 우리에게 자신감을 준다. 그러나,이 절차는 또한 DNA의 높은 금액가 (10 – 20μg) 사용하는 경우에는 단백질 overexpression을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리도 DsRed2 또는 혼자 EGFP로의 연결을 세포질에 레이블을하지만, 우리가 신경을 transfect하는 데 사용하는 plasmids은 일반적으로, EGFP 또는 mCherry 융합 단백질을 포함하고 있습니다. 이 electroporation 기술은 벡터의 번호와 잘 작동합니다. 우리는 CMV 향상제 및 β – globin과 β – 굴지의 프로 모터를 포함 plasmids를 선호 쓰임새 표현의 상대적으로 높은 수준으로 인해 꼬리 (pCAGGs 또는 pCAX plasmids) 9,, 그들은 뉴런에 의해 잘 용납있다는 사실 – 단기 및 장기 문화를 모두 인치 일반적으로, 단백질은 도금의 약 4 시간 이내 Express 및 10 – 24 10 시간 영상에 충분한 수준에 도달하기 시작합니다. 우리는 성공적으로 단기 문화에 CMV – 발기인 기반 plasmids를 사용해야하지만, 그들은 장기적인 문화에 신경을 죽일 것을 overexpression 높은 수준을 일으킬 수 있다고 나타났습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 낮은 밀도 문화의 glial 에어컨 높은 밀도를 (비 – glial 공급) 문화에 비해, CMV – 발기인 구동 plasmids와 transfected 뉴런의 생존과 도움 것으로 나타났습니다.
The authors have nothing to disclose.
모든 절차 애니멀 케어에 위스콘신 대학위원회의 승인 및 NIH의 지침에 따라 하였다. 우리는 그녀의 Nucleofector 장치의 관대한 사용하기 위해 박사 캐서린 칼릴 감사합니다. 우리는 프로토콜에 대한 덧글에 대한 덴트 실험실의 구성원을 또한 감사드립니다. 이 작품은 EWD 부여 NIH R01 – NS064014, 다나 재단과 화이트홀 재단에 의해 지원되었다
크리스토퍼 Viesselmann, 제이슨 Ballweg와 데릭 Lumbard이 종이에 똑같이 기여.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Sodium Borate | Fisher | S93356 | Store borate buffer at room temperature (RT). | |
Poly-d-Lysine | Sigma | P7886-100mg | Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C. | |
Trypsin (10x) | Invitrogen | 15090-046 | Store aliquots at -80°C. | |
DNase (10x) | Sigma | DN25-1G | Store aliquots at -80°C. | |
MEM | Invitrogen | 11095-080 | Store at 4°C. | |
HBSS (10x) | Invitrogen | 14185-052 | Store at RT. | |
HEPES (100x) | Invitrogen | 15630-080 | Store at 4°C. | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Invitrogen | 15140-122 | Store aliquots at -80°C. | |
Horse Serum | Hyclone | SH3007403 | Store aliquots at -80°C. | |
Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25200-056 | Store at 4°C. | |
Neurobasal E (NB) | Invitrogen | 21103-049 | Store at 4°C. | |
B27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | Store aliquots at -80°C. | |
Glutamine (100x) | Invitrogen | 25030-081 | Store aliquots at -80°C | |
30% Glucose in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP350-500 | Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
3.75M NaCl in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP358-1 | Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH3007003 | Store aliquots at -80°C. | |
Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w) | Fisher | Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1 | Combine in conical tube and melt in boiling water. | |
Concentrated Nitric Acid (HNO3) | Fisher | A509-212 | Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows. | |
5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X) | Sigma | C6645 | Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C |
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.