Nous décrivons ici une stratégie efficace pour enlever les glandes produisant la soie de l'abdomen des femelles veuves noires. Cette procédure permet l'isolement rapide de la production de soie sept glandes distinctes d'une manière hautement purifiée, un processus important pour les enquêteurs étudient la production de soie d'araignée et de l'assemblage de fibres.
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Article de méthode
Microdissection de Black Widow Soie d'araignée des glandes productrices
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Araignées modernes tour des fibres de soie de haute performance avec une large gamme de fonctions biologiques, y compris la locomotion, la proie saisie et la protection de développer 1,2 progéniture. Araignées accomplir ces tâches en faisant tourner plusieurs types de fibres distinctes qui ont diverses propriétés mécaniques. Une telle spécialisation des types de fibres a eu lieu à travers l'évolution des différentes glandes productrices de soie, qui fonctionnent comme des bio-usines de petite taille. Ces bio-usines de fabrication et de stocker de grandes quantités de protéines de soie pour la production de fibres. Grâce à une série complexe d'événements biochimiques, ces protéines de soie sont convertis à partir d'un liquide dans un matériau solide lors de l'extrusion.
Des études ont démontré que mécanique soies d'araignée sont plus forts que l'acier à haute résistance 3. Analyses de comprendre la relation entre la structure et la fonction des fils de soie d'araignée ont révélé que la soie d'araignée se compose essentiellement de protéines, ou fibroins, qui ont dans leurs répète bloc de séquences de protéines 4. Commune signatures moléculaires qui contribuent à la résistance à la traction incroyable et l'extensibilité de la soie d'araignée sont démêlé au travers des analyses d'ADNc de soie traduits. Etant donné les propriétés du matériau extraordinaire de soies d'araignée, les laboratoires de recherche à travers le monde font la course à comprendre et à imiter les processus de filage pour produire des fibres de soie synthétique pour des applications commerciales, militaires et industriels. Un des principaux défis à la filature de la soie d'araignée artificielle dans le laboratoire de recherche implique une compréhension complète des processus biochimiques qui se produisent lors de l'extrusion des fibres provenant des glandes de soie producteurs.
Nous présentons ici une méthode pour l'isolement des sept producteurs de soie différentes glandes de l'araignée veuve noire cobweaving, qui comprend les glandes ampullate majeurs et mineurs [fabrique de soie et d'échafaudages dragline] 5,6, tubuliform [synthétise la soie cas d'œuf] 7 , 8, flagelliformes [fonction inconnue en torchis-tisserands], granulats [rend la soie colle], acinus [emballage proies synthétise et les discussions à oeufs] 9 et piriformes [produit l'attachement de la soie disque] 10. Cette approche est basée sur anesthésier l'araignée avec du gaz de dioxyde de carbone, la séparation ultérieure du céphalothorax de l'abdomen, et microdissection de l'abdomen afin d'obtenir les glandes produisant la soie. Après la séparation des différentes glandes productrices de soie, ces tissus peuvent être utilisés pour récupérer des macromolécules différentes pour différentes analyses biochimiques, y compris quantitative PCR en temps réel, dans le nord-ouest et le buvard, spectrométrie de masse (MS ou MS / MS) des analyses pour identifier nouvelles séquences de protéines de soie, la recherche de protéines qui participent à la voie d'assemblage de soie, ou utiliser les tissus intacts pour la culture cellulaire ou d'expériences histologiques.
Protocole
1. Anesthésier l'araignée et l'isolement de l'abdomen
- Transfert de l'araignée d'un bocal en verre dans une boîte en carton doublée de plastique (figure 1A). Nous recueillons généralement araignées de tas de bois, des garages ou des buissons et les loger dans le laboratoire dans des bocaux en verre. Parce que l'araignée ne peut pas monter le revêtement en plastique, elle fournit une méthode efficace pour le transfert de l'araignée à partir d'un bocal en verre ou un café dans un petit peut flacon à des fins d'anesthésier. Alors que la manipulation de l'araignée à ce stade, vous devriez porter deux paires de gants en latex ou des gants de jardinage pour des r....
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Discussion
Notre méthodologie pour la microdissection des glandes produisant la soie de l'araignée veuve noire offre un moyen efficace d'obtenir hautement purifiées de la soie des glandes productrices. Les dissections peuvent être complétés dans 1,5 à 3 heures, ce qui donne un ensemble complet de sept distincts de soie des glandes productrices d'cobweavers. Obtention hautement purifiées de la soie de la glande échantillons permet aux enquêteurs la possibilité d'effectuer un large éventail d'études biochimiques,.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention NSF RUI MCB-0950372 Caractérisation moléculaire droit de Black Silks Veuve.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chlorure de sodium | Electron Microscopy Sciences | SX0420-1 | 0,1 M dans l'eau |
| Pyrocarbonate de diéthyle | Sigma-Aldrich | D-5758 - 5 ml | 0,1 % v/v |
| Citrate de sodium | Sigma-Aldrich | S1804 - 1 kg | 0,015 M dans l'eau |
| Microscope stéréoscopique | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Caméra numérique pour microscope | Leica Microsystems | DFC320 | Logiciel - Leica Application Suite v2.8.1 |
| Ciseaux de Vannas | World Precision Instruments, Inc. | 500260 | |
| Pinces en acier inoxydable | World Precision Instruments, Inc. | 501764 | Mini Dumont n° M5S |
| Épingles à insectes | Indigo Instruments | 33414-2 | Épingles à insectes n° 2 |
| Plats de dissection petits ou grands | Living Systems Instrumentation | DD-50-S ou DD-90-S | 52 mm de diamètre × 18 mm de hauteur (profondeur Sylgard ~6 mm) ou 93 mm × 22 mm |
| Drosophila tubes de culture | Carolina Biological | FR-17-3076 | Dimensions : 31,75 mm de diamètre × 101,6 mm |
Références
- Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys....
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