Rekombinant RBD tabanlı SARS Aşılar için Protokol: Protein hazırlanması, Hayvan Aşılama ve Nötralizasyon Algılama

Summary

Bu protokol, SARS karşı rekombinant reseptör-bağlayıcı etki alanı (RBD) tabanlı altbirim aşılar eğitim için genel bir yordam açıklanır. RBD 293T hücrelerinin protein, RBD ve fare sera kurulmuş bir SARS pseudovirus nötralizasyon tayini ile nötralizasyonu aktivitesi tespit ile farelerin bağışıklık transfeksiyon ve anlatım yöntemleri içerir.

Abstract

Güvenlik profili ve enfeksiyonlara karşı güçlü bir bağışıklık yanıtları uyardığı yeteneği dayanarak, alt ünite aşıları ^1-3 patojenleri geniş bir yelpazede aday olarak kullanılmaktadır. Memeli hücresi sistemi, böylece düzgün katlanmış ve glikozile proteinleri oluşturan, post-translasyonel değiştirme yeteneğine sahip olduğu için, memeli hücrelerinde ifade rekombinant proteinlerin yüksek antijenik ^ve immünojenite 4-6 korumak için en büyük potansiyel göstermiştir.

SARS, 2004 yılından bu yana hiçbir yeni vaka bildirilmiş olmasına karşın, gelecekte salgınları sürekli bir tehdit ve bu nedenle, SARS-CoV karşı aşıların geliştirilmesi, ihtiyatlı bir önleyici adımdır ve yapılmalıdır. SARS-CoV S protein RBD reseptör bağlayıcı ve virüs enfeksiyonu ^7-9 karşı spesifik nötralizan antikorlar indüksiyon önemli rol oynar. Bu nedenle bu protokol, RBD tabanlı altbirim SARS karşı aşı geliştirmek için yeni yöntemler açıklanmaktadır. Kısaca, rekombinant RBD protein (rRBD), uygun konformasyon ve yüksek ^{immünojenite} 6 ile doğru katlanmış bir protein elde etmek için, memeli 293T hücrelerinin kültür süpernatant ifade edildi. Hücrelere rekombinant plazmid kodlama RBD transfeksiyon sonra, bazı değişikliklerle birlikte kalsiyum fosfat transfeksiyon ^yöntemi 6,10 kullanılarak gerçekleştirildi . Lipid transfeksiyon yöntemi ^11,12 ile karşılaştırıldığında, bu değiştirilmiş kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi işlemek için ucuz, kolay ve uygun boyutu ve şekli ile transfeksiyon kompleksi ^13,14 oluşur kez yüksek etkinliğini ulaşmak için bir potansiyele sahiptir. Son olarak, SARS pseudovirus nötralizasyon tayini protokol tanıttı ve sera rRBD protein ile aşılanan farelerin nötralize aktivite tespit etmek için kullanılır oldu. Bu testte, nispeten güvenli, bulaşıcı bir SARS-CoV dahil değildir ve bir biyogüvenlik-3 ^laboratuvar 15 gereksinimi olmadan yapılabilir .

Burada açıklanan protokol aynı zamanda örneğin, HIV, respiratuar sinsisyal virüs (RSV), Ebola virüsü, grip virüsü gibi, Nipah ve Handra virüsler, tasarım ve diğer virüslere karşı rekombinant altbirim aşıları sınıf I füzyon proteinleri ile çalışma kullanılabilir. Buna ek olarak tüm bu virüslerin pseudovirus üreten ve daha sonra pseudovirus nötralizasyon tayini kurulması için yöntemler uygulanabilir.

Protocol

1. Rekombinant SARS-CoV RBD Protein Hazırlık Kalsiyum fosfat transfeksiyon reaktif hazırlayın 2X HBS tampon hazırlanması: 16 g NaCl, 0,4 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O ve Hepes 13,0 g birlikte karıştırın. PH 7.00 ayarlayın ve toplam hacmi 1000 ml distile su getirmek. Sterilizasyon, kısım için çözüm filtreleme ve -20 ° C'de saklayın sonra İpucu: pH değerinin herhangi bir değişiklik transfeksiyon sonuçlarını etkileyebilir. Böylece, etrafında birkaç pH değerleri 7.00 (örneğin, 6.99, 7.00, veya 7.01) test etmek ve aşağıda tanıtılan yöntem kullanarak transfeksiyon için en uygun olanı bulmak için tavsiye edilir. 2.5 M CaCl 2 hazırlık: 73.5 g CaCl 2 * 2H 2 O son hacim 200 mL distile su ekleyin. Filtre -20 ° C'de çözüm ve mağaza Rekombinant plazmid transfeksiyon ve protein saflaştırılması Transfeksiyon 24 saat önce confluency 293T hücrelerin% 50-70 Böl. 40 ml DMEM FBS ve% 1 penisilin / Streptomisin (P / S) 37% 10 ısı ile inaktive edilmiş (HI) içeren ° C,% 5 CO 2 T-175 cm 2 doku kültürü şişeler hücrelerin büyütün . Tüm transfeksiyon ayıraçları, önce oda sıcaklığına kadar transfeksiyon getirilmelidir. Bu reaktifler 2X HBS, 2.5M CaCl 2 dih 2 O, ve rRBD plazmid 6 içerir. İpucu: protein ekspresyonu kültür süpernatant ifade rekombinant proteinlerin salgılanmasını sağlamak için bir sinyal peptid içermelidir son rekombinant plazmid inşa. 6x Onun etiketi için kolay arıtma ifade protein C-terminal eklenebilir. 50 ml (A) ve 15 ml (B) BD Falcon tüp hazırlanması ve Tablo 1'de gösterildiği gibi tüplere reaktifler eklemek. Tüp B tüp A. 2X HBS tampon, 2.5M CaCl 2 eklemek ve plazmid rRBD ve dih 2 O. gereksinimi ses getirmek A. Bir T-175 cm 2 doku kültürü balonuna (4000 mcL / şişesi): rRBD ifade hazırlanmak Tüp A Tüp B 2X HBS 2000 mcL 2.5M CaCl 2 200 mcL rRBD plazmid DNA 40 mikrogram Dih 2 O 2000 mcL B. Bir 100-mm petri (1000 mcL / yemek): SARS pseudovirus üretim için hazırlamak Tüp A Tüp B 2X HBS 500 mcL 2.5M CaCl 2 50 mcL SARS-CoV S plazmid DNA 5 mikrogram (PNL4 3.luc.RE) HIV-1 plazmid 5 mikrogram Dih 2 O 500 mcL Tablo 1: Transfeksiyon karışım hazırlama ve birimler Tablo 1'de belirtilen miktarlar bir transfeksiyon ünitesi için. Daha fazla matara veya yemekler transfeksiyon için kullanılırsa, buna göre hacimleri ayarlayabilirsiniz. Bir girdap sabit ve yumuşak bir karıştırma korurken, tüp damla damla bir şekilde bir tüp B DNA kalsiyum çözüm ekleyin. Karışımı 20-30 dakika oda sıcaklığında bekletin. Başarılı kalsiyum fosfat transfeksiyon için anahtar boyutu ve şekli, oluşan çökelti bağlıdır. Böylece, karışımın bir sonucu olarak, transfeksiyon etkinliğini arttırmak, bu gereksinimi karşılamak için sürekli ve yavaş yavaş vortekslenmiş ve olmalıdır. 293T hücreleri (4000 mcL / balon) içine damla damla ve hatta bir şekilde karışımı ekleyin. 37 ° inkübatör Kültür hücreleri ° C,% 5 CO 2 . Taze serum OPTI-MEM İndirgenmiş-Serum Orta (50 ml / balon) 8-10 saat sonrası transfeksiyon ile kültür ortamı değiştirin. Kültür hücreleri aynı durumun iki gün daha devam edin. Süpernatant içeren ifade rRBD protein 72 saat sonrası transfeksiyon toplayın. Hücre enkaz kaldırmak için 6000 rpm'de 15 dakika santrifüjleyin. 4 ° C gecede toplanan süpernatant ve mağaza proteaz inhibitörü kokteyl ekleyin. Ertesi gün, Ni-NTA Superflow aşağıdaki üreticinin talimatlarına kullanarak kültür süpernatant rRBD rekombinant protein arındırmak. Amicon Ultra -15 konsantrasyon tüpler kullanılarak proteinin saflaştırılmış konsantre ol. Protein konsantrasyonuPBS toplama tüplerine ekleyin ve imidazol elüsyon tampon kaldırmak için tekrar santrifüj. -80 ° C kullanana kadar az protein saflaştırılmış protein konsantrasyonu ve mağaza hesaplayın. 2. Fare Bağışıklama ve Örnek Toplama 40-45 Pre-sıcak Sigma adjuvan sistemi (SAS) ° C ile üreticinin talimatlarına göre. Flakon başına 1 ml PBS ekleyin ve iyice karıştırın. Tablo 2'de protokole göre protein-adjuvan emülsiyon hazırlayın. Pipet, 1.5 mL tüp içine rRBD protein hesaplanır. SAS adjuvan eşit hacim ve emülsiyon oluşturmak için 2-3 dakika boyunca kuvvetlice vorteks tüp ekleyin. İpucu: Tablo 2'de belirtilen miktarlar bir fare. Hacimleri kullanılan gerçek fare numaralarına göre ayarlayın. Her grup için, her aşı için gerekli protein ve adjuvan karıştırın. Doğruluğunu sağlamak için aşılama için her zaman ekstra bir örnek hazırlamak. Grup 1 st aşı (200 mcL / fare) 2 nci aşı (200 mcL / fare) 3 üncü aşı (200 mcL / fare) rRBD protein PBS içinde 20 mg protein (100 mcL) + 100 mcL SAS PBS içinde 10 mg protein (100 mcL) + 100 mcL SAS PBS içinde 10 mg protein (100 mcL) + 100 mcL SAS PBS kontrolü 100 mcL PBS + 100 mcL SAS 100 mcL PBS + 100 mcL SAS 100 mcL PBS + 100 mcL SAS Tablo 2: Fare bağışıklama protokolü Subkutan prime-bağışıklık kadın BALB / c farelerde (eski 4-6 hafta, 5 fare / grup) ve rRBD ve SAS ile iki kat artırmak gibi Tablo 2'de gösterilmiştir. PBS grup kontrol olarak kullanın. Genellikle seçilen subkutan enjeksiyonlar için site, kürek kemikleri arasındaki gevşek deri. Alternatif olarak, ventral karın enjekte etmek kolaydır, çünkü yaygın olarak kullanılır, ve herhangi bir sızıntı enjeksiyon siteleri gözlemlemek olabilir. Tekrarlanan doz aşı kullanıldığında, potansiyel yerel deri reaksiyonları önlemek, çeşitli enjeksiyon siteleri seçmek kolaydır. Her aşıdan sonra aşılama ve 10 gün önce 56 ° C'de 30 dakika için tamamlayıcı inaktive anestezi ile retro-orbital, ısı ve sera ile fareler Bleed. Kullanana kadar -20 ° C'de saklayın fare sera. 3. Nötralizasyon Algılama kullanarak Pseudovirus Nötralizasyon Testi SARS pseudovirus hazırlayın Transfeksiyon önce 100 mm doku kültürü petri kaplarına (2×10 6 hücre / yemek) 16 saat 293T hücreler Split, ve yukarıdaki gibi hücreleri büyümek. Tablo 1'de gösterildiği gibi transfeksiyon ayıraçları hazırlayın. Co-transfect plazmid kodlama SARS-CoV S protein ve plazmid kodlama Env kusurlu, lusiferaz-HIV-1 genom ifade (pNL4 3.luc.RE) kalsiyum fosfat transfeksiyon reaktifi kullanılarak. 10 ml taze DMEM% 10 FBS ve% 1 P / S 8-10 saat sonrası transfeksiyon içeren orta değiştirin. Süpernatant içeren SARS pseudovirus 72 saat sonrası transfeksiyon toplayın. 0.45 mikron filtre ile filtre pseudovirus. Kısım ve mağaza -80 ° C kullanana kadar. SARS pseudovirus nötralizasyon tayini 16 saat önce 96-iyi doku kültürü plakaları 4 cells/100 mcL / 10 SARS-CoV reseptörü ACE2 (ACE2/293T) ifade 293T hücreleri enfeksiyon Bölünmüş. ACE2/293T hücrelerde virüs titresi tespit etmek için 2 kat SARS pseudovirus sulandırınız. Seri 96-iyi doku kültürü plakaları fare sera sulandırmak ve titre SARS pseudovirus eşit miktarda ekleyin. 1 saat 37 ° C'de plakaları Preincubate ACE2/293T hücreleri inkübasyondan sonra, sera pseudovirus karışımı 100 mcL ekleyin ve 37 ° hücreler büyümeye devam ° C,% 5 CO 2 . Taze DMEM 24 saat sonra ekleyin. Tamamen kültür süpernatantlar plakaları 72 saat enfeksiyon sonrası çıkarın. 1X lusiferaz hücre kültürü reaktifi (60 mcL / iyi) ekleyin ve oda sıcaklığında 1-2 saat süreyle sabit plaka titreme ile hücre parçalama teşvik. Luminometre tabak içine transfer hücre ilginçtir (50 mcL / iyi) (Microfluor 96-kuyucuğu). Lusiferaz tahlil sistemi dahil lusiferaz substrat (50 mcL / kuyu) ekleyin ve Ultra 384 luminometre göreli lusiferaz aktivitesini algılar. % 50 nötralizan antikor titresi (NT 50) 6 olarak SARS pseudovirus nötralizasyon titresi ve mevcut hesaplayın.

Discussion

Hücre yoğunluğu kalsiyum fosfat tabanlı transfeksiyon etkinliğini etkileyen önemli bir faktördür. Deneyimlerimize göre,% 70 daha az hücrelerin confluency en iyi sonuçları getiriyor. Böylece, transfeksiyon verimliliğini artırmak için, hücre yoğunluğu confluency, yaklaşık% 50-70 tutulması tavsiye edilir. Kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntem genellikle lipid transfeksiyon ¹⁶ gibi diğer transfeksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha az etkili olduğu düşünülmektedir. Ancak, bu protokolde, böylece Transfeksiyonu verimliliği artırmak, sürekli ve yavaş bir girdap transfeksiyon çözüm karıştırma uygun boyutu ve şekli ile bir çökelti oluşumunu sağlar böylece değiştirilmiş bir kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi kullandı.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
NaCl		Sigma	S7653
Na2HPO4*7H2O		Sigma	S2429
HEPES		Sigma	H3375
CaCl2*2H2O		Sigma	C5080
DMEM		Invitrogen	12430
HI FBS		Invitrogen	10438
Penicillin/Streptomycin		Invitrogen	15140
OPTI-MEM I Medium		Invitrogen	31985
Protease inhibitor cocktail		Roche	11836170001
Ni-NTA Superflow		Qiagen	30450
Sigma adjuvant system		Sigma	S6322
Luciferase assay system		Promega	E1501
Luciferase cell culture lysis reagent (5X)		Promega	E1531
Amicon Ultra – 15		Millipore	UFC901024
Microfluor 96-well plates		Thermo Scientific	7905
Ultra 384 luminometer		Tecan Systems