Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות
Summary
כמה נישות ותאי גזע צורה במהלך הפיתוח היא שאלה חשובה עם השלכות מעשיות. ב<em> תסיסנית</em> השחלה, קו נבט גזע תאים סומטיים נישות שלהם צורה במהלך התפתחות הזחל. וידאו זה מדגים כיצד לנתח, הכתם הר בלוטות המין הנשי מ instar third מאוחר (LL3)<em> תסיסנית</em> הזחלים.
Abstract
איברים רבים תלויים בתאי גזע לפיתוח שלהם במהלך embryogenesis ו לצורך תחזוקה או תיקון במהלך החיים הבוגרים. ההבנה כיצד בתאי גזע צורה, וכיצד הם מתקשרים עם סביבתם היא קריטית ולכן הבנה, פיתוח הומאוסטזיס ומחלות. השחלה של זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster שימש מודל השפעה על האינטראקציה של קו נבט מתאי גזע (GSCs) עם תאים סומטיים התמיכה שלהן (נישה) 1, 2. מיקום ידוע של נישה לבין GSCs, מצמידים את היכולת לתפעל אותם גנטית, אפשרה לחוקרים להבהיר מגוון רחב של אינטראקציות בין בתאי גזע נישות שלהם 3-12.
למרות שפע של מידע על מנגנוני השליטה תחזוקה בידול GSC ו, יחסית מעט מאוד ידוע על איך GSCs נישות סומטיים שלהם צורה במהלך ההתפתחות. כ 18 סומטיים נישות, שמרכיביו כוללים הסלולר נימה מסוף ותאי כובע (איור 1), טופס במהלך השלישי הזחל instar 13-17. GSCs שמקורם בתאי הנבט הראשוני (PGCs). PGCs להתרבות הזחל בשלבים המוקדמים, אך בעקבות היווצרות של הגומחה תת קבוצה של PGCs הופך GSCs 7, 16, 18, 19. יחד, תאים סומטיים נישה ואת GSCs לעשות יחידה תפקודית שמייצר ביצים לאורך כל החיים של האורגניזם.
שאלות רבות בדבר הקמת יחידת GSC נותרו ללא מענה. תהליכים כגון תיאום בין התאים מבשר עבור נישות ו מבשרי תא גזע, או דור אסימטריה בתוך PGCs כאשר הם הופכים GSCs, יכול להיות הכי טוב למד הזחל. עם זאת, מחקר שיטתי של התפתחות השחלה הזחל הוא מאתגר מבחינה פיזית. ראשית, השחלות הזחל הם קטנים. אפילו בשלבי הזחל המאוחרות הן 100μm רק לרוחב. בנוסף, השחלות הם שקופים המוטבעים בגוף שומן לבן. כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לבידוד מן השחלות הזחלים מאוחר third instar תסיסנית (LL3), ואחריו צביעה עם נוגדנים ניאון. אנו מציעים כמה פתרונות טכניים לבעיות כגון איתור השחלות, מכתים ושטיפת רקמות שאינן כיור, ולוודא כי נוגדנים לחדור לתוך הרקמה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שלבי הזחל מוקדם כדי האשכים הזחל וכן.
Protocol
Discussion
וידאו זה מדגים בידוד פרוטוקול מכתים של המנוח השחלות instar third הזחל. כדי לבצע פרוטוקול קבוע ואמין, יש לשים לב לנקודות הבאות:
- עבור הזחלים מסונכרן מפותח, על הצפיפות יש להימנע.
- כדי למנוע אובדן של ה…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IM נתמך על ידי מענק קירי מחדש אינטגרציה מארי. עבודה זו נתמכה על ידי שום מדע בישראל מענק הקרן. 1146-1108, על ידי הלן ומרטין קימל המכון למחקר בתאי גזע במכון ויצמן למדע וקרן הצדקה של Leir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | J.T.Baker | |||
| Kcl | Merck | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| MgCl2 | Merck | |||
| Sucrose | J.T.Baker | |||
| Hepes | Sigma-Aldrich | |||
| PBS | Sigma-Aldrich | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | |||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | ||
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | FST Fine Science Tools | 11295-10 | ||
| Nickel plated pin holder | FST Fine Science Tools | 26018-17 | ||
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | FST Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | CORNING | 7220-85 | ||
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica | |||
| 6 well plates | Costar | 3516 | ||
| Slides | Menzel Glaser GmbH | 798 | ||
| Cover slips | Corning | 2940-223 | ||
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | ||
| Cell strainer | Falcon | FAL352350 | ||
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | |||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | |||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | |||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | |||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).
- Chen, D., McKearin, D. Gene circuitry controlling a stem cell niche. Curr Biol. 15, 179-184 (2005).
- Kai, T., Spradling, A. An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).
- Kai, T., Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries. Nature. 428, 564-569 (2004).
- Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development. 135, 533-540 (2008).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Tazuke, S. I. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Xie, T., Spradling, A. C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 94, 251-260 (1998).
- Xie, T., Spradling, A. C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. , 290-328 (2000).
- Guo, Z., Wang, Z. The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary. Development. 136, 3627-3635 (2009).
- Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila. Nature. 455, 72-77 (2008).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental biology. 170, 127-135 (1995).
- Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary. 134, 1071-1080 (2007).
- Zhu, C. H., Xie, T. Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila. Development. 130, 2579-2588 (2003).
- Ward, E. J. Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary. Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance. Curr Biol. 14, 981-986 (2004).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad. Nature. 443, 97-100 (2006).
