着床前遺伝子診断のためのFISH

Summary

この記事では、シングルセルFISH、割球の核の拡散技法、およびin situハイブリダイゼーションと臨床の現場で着床前遺伝子診断（PGD）に印加さ​​れる信号のスコアリング、適したプローブの選択について説明します。

Abstract

着床前遺伝子診断（PGD）は、胎児診断に確立された代替手段であり、そして生殖補助技術（ART）によって生成されたコホートから着床前の胚を選択することが含まれます。一方のパートナーは、染色体の再配列（例えば、双方向の相互転座）搬送するため、この選択があるため家族性単一遺伝子疾患（例えば、嚢胞性線維症）が必要、または可能性があります。 PGD​​は、および/または染色体再配列、再発性流産、または不妊の場合には、以前の影響を受ける子供たちを持っていたカップルのために利用可能です。卵母細胞は、以下の卵巣刺激が精液を用いたin vitro浸漬（IVF） にするか、個々の精子（ICSI）の細胞質内注入によって受精されている吸引。着床前の切断段階の胚は、通常3日後の受精で単一細胞の除去によって、生検を実施している、と生検細胞は、胚の遺伝的地位を確立するためにテストされています。標的特異的DNAプローブと生検細胞の固定核のin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光は、染色体再配列に関連付けられている染色体の不均衡を検出するための選択のテクニックであり、そしてそこにであるためにX連鎖性疾患を持つ家族の女性の胚を選択するは変異しない固有のテスト。 FISHは、試してみて、生殖補助の効率を向上させるために、自発的な染色体の異数性（またPGSとして、またはPGD – AS知られている）のための画面の胚にも使用されていますが、拡散とFISH法を用いてこの試験の予測値は、ここで説明ほとんどの人々の手に許容できないほど低くなる可能性が高いと、それは日常的な臨床使用は推奨されていません。我々は、単一セルFISH、割球の核の拡散技術、及びin situハイブリダイゼーションと臨床の現場でPGDに印加される信号のスコアリング、適したプローブの選択について説明します。

Protocol

1。生検割球から核を溶解し、拡散拡散セル（0.01 M塩酸に0.2％のTween20、pHは2.0）のための細胞溶解バッファーは、事前に24時間を用意し、-20℃で保存してください。滅菌20mLのシリンジとシリンジフィルターを用いて30 mLの滅菌ユニバーサル容器に100 mLとフィルタ20 mLを準備する。 10月15日を1.7 mL滅菌マイクロ遠心チューブに1 mLのアリコートを分注、閉じて、前に凍結するチューブにラベルを付けます。それは、新しいバッチが不十分である場合、テストされており、使用することができます使用される二つの異なるバッチ、新規のバッチと、以前のバッチを、持っていることをお勧めします。 デフロストの30分生検の手続きの前に室温で溶解バッファー。実用的な目的のために働く温度は室温と手の温度の間になります。 ダイヤモンドのペンと事前にラベルをケースの数、ユニークなスライド番号、および生検の日付とスライドを使用して、アミンコーティングしたスライド（例えばGenetix）の下側にある小さな円を（約5 mmの直径）のスコア。別々の番号順に各割球用スライド、および胚の数とラベルを使用してください。スライドは、4Hのような硬い鉛筆で標識し、任意のグラファイト塵を除去するためにラテックスの手袋と"ブロット"する必要があります。 サークル内での溶解緩衝液少量を置きます。 溶解バッファー中に生検割球を移す。細胞が溶解し始めるまでに必要な円の中に溶解バッファーを追加した場合、セルは完全に溶解する必要がありますし、細胞質には、バッファが乾燥する前に分散させる。 それは円の中に残っていると失われないことを保証するために核を観察し、細胞が核を持っているか、複数の核を持っていない場合は、別のセルを生検。 室温で空気乾燥にスライドしておきます。 （2）単一割球の核のin situハイブリダイゼーション 滅菌蒸留水で構成されたエタノールシリーズ（70、90および100％）を準備する。 ℃をオンにして75にホットブロック（例えばHybaid OmnislideまたはバイシスHybrite）を設定します。 デフロストプローブ、渦、および遠心。試薬を目撃し、プローブの混合物を構成する前に、正しいことを検証する必要があります。ピペット0.65 mLの滅菌マイクロ遠心チューブに、使用前にボルテックスと遠心でプローブの混合物を補うために製造業者によって指定されたボリューム。プローブの混合物の合計量は、核あたり2μLをテストし、安全マージンを可能にするために最も近い10μLに切り上げできるようにするには十分なはずです。 室温で5分間。：使用してリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（0.14 MのNaCl、3mMのKCl、10mMののNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4 pH7.0）をコプリンジャーにスライドをプレ洗浄滅菌蒸留水で2回スライドを洗浄します。 室温と空気乾燥で2分間ずつエタノールシリーズ（70、90、および100％）でスライドを脱水する。スライドが完全に浸漬し、任意のグラファイト塵が表面に浮く場合、きれいなティッシュで吸い取りされていることを確認します。 位相差顕微鏡で視覚化することによって円の中に核の位置を記録します。 室温と空気乾燥で2分間、100％エタノールで脱水。 プローブの混合物の2μLを適用する、と9 × 9mmのカバー（18 x 18のmm第1カバースリップの4分の1）でカバー。 ラバーセメント（;牛の校正などの牛ガム）でカバースリップの端をシールします。 37℃加湿チャンバー内（16〜20時間）一晩のスライドをハイブリダイズし、5分間75℃でホットブロック上でスライドをCodenature、と℃のセントロメアプローブ（劣性ケースの例）だけで構成されるプローブミックスは、ハイブリダイゼーションの60分後に満足のいく結果が得られます。 71に十分なコプリンジャーと熱と水の風呂を沸かす℃に 0.4x標準クエン酸生理食塩水（SSC）厳しい洗浄溶液（71時のpH 7.0 ° C、0.06 MのNaCl、6 mMのC 6 H 5のNa 3 O 7 · 2H 2 O）と水浴中で熱を準備。 必要なコプリンジャー当たり厳しい洗浄50mLを分注し、温度が71であることを確認してください° C直ちに清浄な温度計を使用して、使用する前に。 慎重に各スライドからゴムセメントを除去し、室温で4倍SSC/0.05％のTween20（pH7.0）を用いてカバースリップを洗い流す。 71で0.4x SSC厳しい洗浄でスライドを洗う℃で5分間。コプリンジャーあたり1 6よりもスライドを洗浄してください。 2分間、室温で4倍SSC/0.05％のTween20をでスライドを洗浄してください。 プローブミックスは、間接的に標識プローブ（複数可）が含まれている場合、余分な液体のスライドを排出し、パラフィルムの20 × 20mm角の下に蛍光標識抗体20μLを適用します。 37℃加湿チャンバー内でインキュベート℃で15分間。 パラフィルムを外し、2分間、室温で4倍SSC/0.05％のTween20をで一度洗う。 PBSで2分間2回洗浄するtの室温とスライドを排出。 ない22 × 22 mmまでDAPI / Vectashield（4、160 ngの"Vectashieldマウンティング培地、ベクターラボラトリーズの1 mLの1,6 – ジアミジノ-2 – フェニル二塩酸塩）の6μLを適用します。 0カバーガラスとカバーグラス上にスライドして反転。 ブロットおよび明確なマニキュアでカバースリップの端をシールします。 3。蛍光顕微鏡を用いた解析では、好適に用いるプローブのための適切なフィルターを装備。 アッセイにおける蛍光顕微鏡および各蛍光色素の単一バンドパスフィルタを使用して直接可視化によるスコアの信号。それぞれの原子核は2つのアナリストによって得点されるべきである。一般的なガイドラインは、狭い間隔で2つの信号が離れて一つのドメイン（信号幅）未満の単一の信号の得点につながる必要がありますが、経験に基づく判断は大きさ、強度、および分離を様々な信号を解釈するために行使する必要があります。 視覚的な診断の確認のため、および実験室の品質保証計画の一環として、画像のアーカイブのために核の画像をキャプチャするために、イメージングソフトウェア（CytoVision、Genetix等イシス、メタシステム、Altlussheim、ドイツ）を使用してください。 4。代表的な結果： 培養末梢血リンパ球から分裂中期および間期核は、選択されたプローブは、ブレークポイントのための有益な、転座の染色体に特異的な（subtelomereプローブが中心に転セグメントとセントロメアプローブ（s）にのみハイブリダイズすることを確認するために検討する必要がありますセグメント（S））と間期核に信号が明るいと離散してください。各パートナーか​​ら100間期核内の各プローブの信号の数を得点とアッセイの効率を評価することをお勧めします。この場合、2つの信号は、各プローブの核の95％-99％でスコア化した。図1は、染色体5および9の短腕の間に相互転座のための準備から分裂中期および間期核を示しています。 胚の割球から間期核内の信号は、明るく、離散的になると使用される色に別々のバンドパスフィルタを使ったスコア付けてください。図2は、第5染色体と9の通常またはバランスのとれた染色体の補数との一貫性のある正常な信号パターン（テストされたすべての遺伝子座の2コピー）、および転座のアンバランスの製品との一貫性のある異常な信号パターンを持つ原子核と割球の核を示しています。それは第5染色体と9番染色体の転セグメントのトリソミー（3部）の転セグメントのモノソミー（つのコピー）があります。 図1分裂中期スプレッドと5p14.3と9p24.1における染色体5とブレークポイントの9の短腕との間の相互転座のキャリアから培養した末梢血リンパ球から調製した間期核：46、XY、T（5 、9）（p14.3; p24.1）っぽいT（5、9）（5ptel48 -、9ptel30 +; 9ptel30 -、5ptel48 +、9cen +）。 （; 9p24.1→9pter、緑Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC 5p14.3→5pter、赤Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed）と9番染色体の中心部分（9p24.1→9qter、青アボットCEP 9 FISHプローブは、転セグメントの両方のために選択したアルファサテライトSpectrumAqua）。 日- 3胚から間期割球の核の図2。シグナルは、それぞれの蛍光色素との複合画像を形成するために合併のための異なるフィルタを使用してキャプチャ。 （A）転座染色体の正常またはバランスの補数と一致している各遺伝子座、2つのコピーを示す各プローブの2つの信号。 （B）一つの赤いシグナル、3つの緑色の信号と第5染色体の転セグメントの1つのコピーを示す2つの青の信号、9番染色体の転座のセグメントの3つのコピーと、隣接すると一貫性のある9番染色体の中心の部分、の2つのコピー9p24.1→9pter用5p14.3→5pterとトリソミーのためのモノソミーとアンバランスの製品で、その結果転座の-1分離。

Discussion

単胚細胞（割球）にin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光のアプリケーションは、実用性にし、信号パターンの解釈の両方の特殊な課題を提示している。細心の注意は、細胞質が分散されていることを、細胞が溶解されることを確実に取られる必要があります、そしてその核、生検細胞はその局在以下のFISHを容易にするために、スライド上のあらかじめ定義されたエリア内に分散する必要がある診断は、この単一のセル、厳格なスコアリングと解釈のガイドラインを適用する必要があるから結果に依存するように、と、目に見えるとそのままです。しかし、経験豊富な手の中に、FISHは、臨床診療における着床前遺伝子診断（PGD）のための堅牢なテクニックです。 FISHによるPGDの原理は、異なる蛍光色素やハプテンで標識された標的特異的DNAプローブは、ロバートソンを含め、特定の遺伝子座のコピー数を検出するために、そしてそれによって染色体再配列の減数分裂分離（1）に関連付けられている染色体の不均衡を検出するために使用できることです転座、相互転座、逆位、および複雑な再編成（2）。 FISHもない突然変異特異的なテスト（3、4）存在しないため、X連鎖疾患を持つ家族の女性の胚を選択するために使用することができます。より多くの論争、FISHは、生殖補助（5、6）の効率を改善するためにために散発的な染色体の異数性のスクリーニングにも使用されていますが、FSIHを使用して、このテストの予測値は、ほとんどの人々のに容認できないほど低い可能性が高いです手とそれは日常的な臨床使用（7）には推奨されません。この記事では、技術的側面と臨床的単一細胞診断に適用されるFISHの限界に集中。

単一の割球を拡散し、固定の方法は、メタノール/酢酸（5、8）、ツイーン/塩酸（9）、およびTween / HClおよびメタノール/酢酸（10）の組み合わせが含まれています。バリエーションは、事前の拡散および/またはペプシンへの細胞の低張処理し、固定後のホルムアルデヒド処理が挙げられる。メソッドは、適切に実験室（14）のために検証する必要があります。トゥイーン/塩酸メソッドは、この記事で詳細に説明されています。トゥイーン/塩酸法では、異なる研究室で技術的に簡単な再現性の高いです。このメソッドは、許容診断精度（7）とのセックスの決定と染色体再配列のFISH診断のための単一の核を準備するために使用することができます。

プローブミックスは、異なるメーカーのプローブ、およびプローブを直接標識して間接的に標識組み合わせることができます。既知の多形性染色体領域のためのプローブ（11,12）、または両方の生殖のパートナーに事前のテストでPGDのための具体的かつ適切であることが示される場合に使用することができますが、他の染色体（13）で有意にクロスハイブリダイズすることが知られているものは、避けるべきである。目の肥えたプローブで使用可能な蛍光色素/ハプテンと戦略は次のとおりです。テキサスレッド（TR）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、SpectrumGreen（バイシス）、SpectrumOrange（バイシス）、SpectrumAqua、TR -アビジンで検出されたビオチン化プローブを、FITC -アビジン、またはをCY – 5ストレプトアビジン（FarRedフィルタを用いて可視化）、黄信号、ハイブリダイゼーションの第二ラウンドと）TexasRedとSpectrumGoldフィルタを使用してSpectrumOrangeのシーケンシャルキャプチャすることにより作成された別の色を生成するために赤と緑のプローブのミックス。

XとY染色体と常染色体つのセントロメア領域の特定の3つのプローブを含むプローブセットは、性別判定（14）をお勧めします。常染色体プローブは、（2N、47トリソミーXとを区別する倍数性とそれによって確立するために使用されます、XXX）と三倍体（3N、69、XXX）、およびテトラソミーX（48、XXXX）とtetraploidy（4N、92、XXXX）の間。このプローブセットは非常に低い多型率を持つことが実証されているため、前処理作業まで生殖パートナーの、典型的なプローブは、α-サテライトX、Y、および18を含むアボットのAneuVysionミックスは、この設定に適用される設定（14）は不要です。

特定の再配置のためのプローブミックスはする必要があります。理想的に染色体の不均衡と再配置のすべての期待される製品を検出するには、少なくとも十分なプローブが含まれています。これが不可能な場合、プローブは検出されずにアンバランスの製品が認識可能な妊娠で非現実的なように評価し、非常に低い有病率は（14）許容さ​​れる場合があるためにそれがある場所ミックス。両方の生殖のパートナーか​​ら培養したリンパ球分裂中期でテストされる。少なくとも10の分裂中期スプレッドは、プローブの特異性、遺伝子多型とクロスハイブリダイゼーションのために検討されるべきである、と、染色体再配列のキャリアのための、プローブとして再配置の異なるセグメントに予想されるハイブリダイズことを確認します。さらに、これらの調製物から少なくとも100間期核は、信号の特異性、明るさ、および離散性（14）を評価するために得点する必要があります。

コムデギャルソンrcial PGSのプローブセットが利用可能である（例えば、アボットMultiVysion PBまたはPGT）、最も頻繁に受胎産物で異数性があることが判明染色体をターゲットとし、標的染色体ごとに単一のプローブで構成される。典型的には核が染色体13、15、16、18、21、22、及びXY（14）についてのアッセイを提供する追加の染色のためのプローブで2番目のハイブリダイゼーションを持つことができます。拡散とFISH技術はここで説明を使用してこのテストの予測値は、ほとんどの人々の手に許容できないほど低くなる可能性が高いと、それは（7、15）日常の臨床使用は推奨されていません。

単一のセルに適用されるような比較ゲノムハイブリダイゼーションなどの手法（CGH）各染色体のコピー数（ウィルトンら、2001）をテストすることができる、と一塩基多型（SNP）アレイと定量分析（の使用Wells ら、2008年）や"karyomapping"遺伝子型は（ハンディーら 2009）染色体の異数性を検出するための代替技術を期待されている。しかし、セグメントの不均衡の解像限界と精度が不安定なままであると、それは魚が小さなセグメントを含む染色体再配列のための選択の手法であり続けるだろうと思われる。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Hydrochloric Acid, 2.5L		VWR	101254H
Sodium Chloride, 5Kg		VWR	443827W
Potassium Chloride, 250g		VWR	26764.232
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g		VWR	102494C
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g		VWR	10203 4B
Sodium Hydroxide Pellets, 500g		VWR	28245.265
Tween20, 500mL		VWR	663684B
Ethanol, 2.5L		VWR	8.18760.2500	Duty Paid
Tri-Sodium Citrate, 5Kg		VWR	27833.363
Cow Gum, 250mL		Cow Proofings Ltd.	No longer available	Old stocks can still be found in art shops
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul		Cytocell	DES500L	150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe
Nail Varnish, 12mL		Boots	10088316001
Amine-coated Slides, 25		Genetix	K2615
DAPI, 0.1mL		Sigma-Aldrich	D-9542
Vectashield, 10mL		Vector Laboratories	H1000
Texas-Red-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2016
FITC-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2011
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL		GE Healthcare	PA45001
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500		Thistle Scientific	AX-MCT-175-C
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000		Thistle Scientific	AX-MCT-060-C-CS
30ml Universal Containers, box of 400		Sterilin	128B	Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053
Hot Block
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick		VWR VWR VWR	451-0107 451-3112 451-3111
Plugged Glass Pipettes		Fisher Scientific	PMK-300-052R
Dissecting Microscope		Wild Heerbrugg
Tissues, 100boxes		NHS SUPPLY CHAIN	MJT058
Metal Culture Trays
Plastic Melamine Trays		VWR	682-009
Oven
Mouth Pipette Mouthpiece		Scientific Laboratory Supplies	HAE3700
Tubing
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter		Fisher Scientific	FDM-340-010U
Diamond Pen		VWR	818-0021
Hot Block for Slides		Thermo Hybaid	HBOSBB
Hybridization Chamber
Tissue Roll		NHS SUPPLY CHAIN	MJT004
Schieferdecker Jar		VWR	631-9313
Coplin Jar		VWR	631-9331
Forceps, Fine		VWR	232-2123
Forceps, Blunt		VWR	232-2113
1000mL Beaker		VWR	213-1642
Phase Contrast Microscope		Nikon	E200
Fibre-free Blotting Cards, box of 100		Fisher Scientific (Raymond Lamb)	SDE1
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3022
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3110
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3104
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3206
1mL Syringe, box of 100		NHS Supply Chain	FWC045
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000		Thistle Scientific	AX-T-1000-C-L-R
Incubator		LEEC
Waterbath		Grant	W22
Alcohol Thermometer				Various sources available
pH Meter		Jenway	3305
pH Electrode		VWR	662-1759	BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305
Heated Stirrer		Bibby	HC502
1mL Pasteur Pipettes, box of 500		Scientific Laboratory Supplies	PIP4202
Parafilm, 50mm x 75m		VWR	291-1214