Time lapse beeldvorming van 3D-weefselkweek maakt het bestuderen van trekgedrag van de individuele cellen die afkomstig zijn van ganglion eminentie in reactie op gefractioneerde eiwitten halen uit cerebrale cortex.
Migratie van cellen is een gemeenschappelijk proces dat leidt tot de ontwikkeling en rijping van de gewervelde centrale zenuwstelsel (Hatten, '99). De cerebrale cortex bestaat uit twee fundamentele neuronale types: prikkelende en remmende. Deze cellen ontstaan in verschillende gebieden en migreren naar de cortex langs verschillende routes (Pearlman et al.., '98). Remmende interneuronen migreren tangentiaal uit subcorticale bronnen, voornamelijk uit verschillende regio's van het ganglion eminenties (Gelman et al., '09;. Xu et al., '04.). Hun beweging vereist een nauwkeurige controle spatiotemporele opgelegd door omgevingsfactoren, zodat voor de oprichting van de juiste cytoarchitecture en connectiviteit in de cerebrale cortex (Caviness & Rakic, '78, Hatten, '90, Rakic, '90). De studie van de trekgedrag van cellen gegenereerd in proliferatieve zones van de ganglion eminenties (GE) bij pasgeboren fretten in vitro hebben we gebruik gemaakt van een 3-dimensionale cultuur arrangement in een BD Matrigel Matrix. De cultuur setup bestond uit twee GE explantaten en een bron van geteste eiwitten uit de cerebrale cortex en geadsorbeerd aan fluorescerende latex Retrobeads IX gepositioneerd tussen de explantaten (Hasling et al., '03;. Riddle et al., '97.). Na 2-3 dagen van de cultuur, de cellen beginnen te verschijnen aan de rand van de explantatie met een neiging om het weefsel te verlaten in een radiale richting. Live-imaging toegestaan observatie van migratiepatronen, zonder de noodzaak van etikettering of markering van de cellen. Bij blootstelling aan fracties van het eiwit extract verkregen uit isochronic fret cortex, de GE-cellen weergegeven verschillende gedragingen zoals beoordeeld door kwantitatieve kinetische analyse van individuele bewegende cellen.
Hier presenteren we een eenvoudig systeem te bestuderen en migratie het gedrag van neurale cellen te analyseren in reactie op chemische signalen. In vitro migratie testen zijn gebruikt om de extracellulaire moleculen die de voortbeweging van de cellen te identificeren. Ons paradigma zorgt ervoor dat elke onderzochte individuele cel een 3-dimensionaal (3D) omgeving waarmee interactie heeft. Het is een groot voordeel ten opzichte van culturen waar de cellen uit migreren van explantaten worden gedwongen te verhuizen op het vlakke oppervlak van poly-D-lysine-gecoate dekglaasje, dus verstoken van interacties met de extracellulaire matrix (bv. Hirschberg et al., '10;. 8. Metin et al.. '07). Maar met betrekking tot de grotere schaal van het bijhouden van migrerende cellen, blijft het 2-dimensionaal, omdat de cellen verticaal beperkt tot de ruimte tussen het glas dekglaasje op de bodem en de bovenkant van Matrigel, dat is relatief dun in vergelijking met de horizontale vrijheid van migratie. Een dergelijke setup zorgt voor een eenvoudigere analyse van beweging, die nog steeds in wezen twee-dimensionaal. Vergelijkbare 3D-paradigma's, bestaande uit GE explantaten of re-aggregaten van GE cellen ingebed in collageen of Matrigel, voorheen in dienst, met behulp van aggregaten van de cellen die een bepaald eiwit signalering als een bron van chemische signalen (bijv. Liodis et al., '07;. Martini et .. al. '09;. Nobrega-Pereira et al., '08; Wichterle et al. '03).. De methode die hier wordt gepresenteerd maakt gebruik van een vertraagde afgifte systeem in de vorm van een latex kralen met gehandeld eiwitten zorgen voor een constant hoog niveau in de plaatselijke omgeving, die hoger is dan eiwitten direct toegevoegd aan het medium, waardoor het systeem uitermate geschikt wanneer het bedrag van de beschikbare eiwit is beperkt of wanneer een complex mengsel van eiwitten is getest. De keuze van kralen is niet beperkt tot latex-gebaseerde producten, en omvat ook andere materialen, bijvoorbeeld agarose parels, elk met verschillende eigenschappen. Verder te verhogen de dichtheid van de test gebruikten we twee explantaten apposed om de kralen storten tegenover elkaar staan. Om ervoor te zorgen een bepaald gebied van herkomst, hebben we gebruik gemaakt ganglion eminentie explantaten als een bron van cellen. Evalueerden we verschillen in de mediale en laterale delen van het ganglion eminentie, maar zag geen verschillen. We moeten erop wijzen dat dit onderzoek fretten gebruikt; in deze soort de mediale en laterale ganglion eminenties eerder zekering dan in knaagdieren (Poluch et al., '08.). Op het moment dat de culturen werden gemaakt (P0) de mediale en laterale ganglion eminenties werden gefuseerd, ook al zijn veel cellen vullen de neocortex nog steeds worden gegenereerd en migratie. Echter, als een echt homogeen bron van cellen heeft de voorkeur, kan een celsuspensie worden bereid uit het weefsel ontleed en direct gemengd met de Matrigel, of als alternatief gesponnen naar beneden en een resulterende pellet geponst om 'explantaten' te maken. Het gebruik van enzymatische vertering weefsel naar de cel suspensie te bereiden wordt afgeraden, want zelfs sporen van proteolytische activiteit kan Matrigel vloeibaar te maken in de loop van het experiment. Ook een due diligence moet worden toegepast op de timing van de cultuur setup. Hoewel Matrigel vergt een periode van opwarming te polymeriseren, zelfs een iets langere periode van blootstelling van kleine druppels Matrigel (zoals gebruikt in dit protocol) om de lucht oorzaken drogen en resulteert in een shell die ondoordringbaar is voor migrerende cellen en die niet kunnen worden gewist door latere afdekken met verse Matrigel.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door DoD Grant PT074620 (SLJ) en NIH Grant R01NS245014 (SLJ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |