체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사하고 인간의 신경 발달을 탐험하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간의 줄기 세포 연구의 증가 재현성의 희망에 culturing 및 passaging hNSPCs의 방법을 보여줍니다.
Abstract
체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사할뿐만 아니라 인간의 신경 발달과 병리 많은 근본적인 과정을 탐구하는 수단을 제공합니다. 이 프로토콜은이 기술을 표준화하고 인간의 줄기 세포 연구의 재현성을 증가 기대에 culturing 및 passaging hNSPCs의 간단한 방법을 제공합니다. 우리가 사용하는 hNSPCs은 국립 인간 신경 줄기 세포 자원에 의해 시체 같은 출생 후의 두뇌 cortices으로부터 격리 및 flasks에 점착 성의 문화가 fibronectin (팔머 외, 2001..; 슈워츠 외, 2003)와 코팅으로 성장했다. DMEM에 우리 문화는 우리 hNSPCs : F12 혈청이없는 미디어 EGF, FGF 및 PDGF와 함께 보충 및 통로들을 1시 2분 약 매 칠일. 이러한 조건을 사용하여 문화의 세포의 대부분은 바이폴라 형태를 유지하고 undifferentiated 신경 줄기 세포 (예 : nestin 및 sox2 등)의 마커를 표현한다.
Protocol
참고 : 일주일에 한번씩 우리 hNSPCs의 일상 culturing 들어, 우리가 매일하고 일반적으로 통로를 1시 2분 미디어 50-100%을 변경합니다. F12 기지 미디어 : 문화 미디어는 20 %의 비트 9500 DMEM에 1X 항생제 / antimycotic 및 성장 요인을 (EGF, FGF 및 PDGF 40 NG / ML 각)이 포함되어 있습니다. 코팅 휴대용 술병을 준비하고 세포를 Dissociating 37 10 μg / 야간 4 시간 또는 EMEM에 ML 인간 fibron…
Discussion
우리는이 프로토콜 hNSPCs의 신뢰할 수있는 문화를 제공하는 것으로 나타났습니다. 우리의 세포에 대한 하나의 중요한 요소들은 상당히 밀도 문화로 보관하고 세포가 스파스되는 시점 passaged 수 없습니다 필요합니다. 우리 손에, 스파스 문화는 매우 느리게 성장 또는 완전히 분열 중지. 문화가 매우 밀도 때 이러한 이유로, 우리는 보통 우리 문화 1시 2분 또는 1시 3분 분할. 그것이 좋은 세포 부착 및 마이 그 레이션…
Acknowledgements
저자는 기꺼이 어린이 병원, 그들의 culturing에 hNSPCs과 초기 교육을 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠 인정합니다.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)
Reagent
Stem Cell Technologies
09500
Antibiotic-Antimycotic
Reagent
Invitrogen
15240-062
DMEM:F12 (1X)
Reagent
Invitrogen
11330-032
EMEM (1X)
Reagent
Mediatech
MT-10-010-CV
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum
Reagent
Invitrogen
10437-028
FGF, human basic recombinant
Reagent
Peprotech
100-18B
PDGF-AB
Reagent
Peprotech
100-00AB
EGF, human recombinant
Reagent
BD Biosciences
CB40052
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2
Tool
Corning
10-126-28
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural
Reagent
BD Biosciences
CB40008A
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells
Cells
National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm
Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture.Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).