מאמר זה לפרטים וידאו הליך ניסיוני להשגת אנרגיה חופשית של גיבס קיפול חלבונים על ידי קרום טריפטופן פלואורסצנטי.
Abstract
חלבון קיפול ממברנה הוא נושא המתעוררים עם משמעות הן היסוד הקשורים לבריאות. שפע של חלבונים בממברנה של תאים בבסיס הצורך במחקר מקיף של קיפול של משפחה זו נפוצה של חלבונים. בנוסף, ההתקדמות יכולתנו לאפיין מחלות הקשורות חלבונים misfolded יש מוטיבציה המאמצים ניסיונית תיאורטי משמעותי בתחום של קיפול חלבונים. ההתקדמות המהירה בתחום חשוב זה מתעכבת לצערי על ידי האתגרים הכרוכים הקשורים חלבונים בממברנה ואת המורכבות של מנגנון קיפול. כאן, אנו המתאר הליך הניסוי למדידת רכוש התרמודינמית של האנרגיה החופשית של גיבס התגלגלות בהעדר denaturant, Δ G ° H 2 O, חלבון קרום נציג בלתי נפרד מן ה coli. פרוטוקול זה מתמקד ביישום של ספקטרוסקופיה פלואורסצנציה לקבוע אוכלוסיות שיווי משקל של מדינות מקפלת כפונקציה של ריכוז denaturant. שיקולים ניסויית להכנת שלפוחית שומנים סינתטי כמו גם שלבים עיקריים בהליך ניתוח נתונים מודגשים. טכניקה זו היא המגוונת ניתן רדף עם סוגים שונים של denaturant, כולל טמפרטורה ו-pH, כמו גם בסביבות קיפול שונים של שומנים micelles. הפרוטוקול הנוכחי הוא אחד כי ניתן להכליל את קרום או חלבון מסיס אשר עונה על סדרה של קריטריונים בהמשך.
Protocol
1. הכנת ~ 50 ננומטר קוטר שלפוחית Unilamellar קטנים (רכבי השטח) עבור קיפול חלבונים ממברנה הפתרון של 1,2-dimyristoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DMPC) שומנים כלורופורם הוא רכש aliquotted לתוך צלוחיות זכוכית נקי 20 מ"ג כמויות בקבוקון לאחסון. שכבה…
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של התגלגלות עקומות של הממברנה הקשורים חלבונים ופפטידים המכילים שאריות טריפטופן. כאן, ההנחה היא כי הקרינה טריפטופן משקף אם החלבון מקופל ונוסף שלפוחית שומנים סינתטי, או פרש בתמיסה. הנחות נוספות, כגון קיפול של שתי מדינות ותלות ליניארית …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים בייג'ינג וו עבור השימוש בנתונים שלה. עבודה זו נתמכה על ידי בפרס קריירה NSF כדי JEK
Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy. J. Vis. Exp. (50), e2669, doi:10.3791/2669 (2011).