Summary

使用荧光免疫化学检测爱德华ictaluri一毛虫)样品

Published: May 10, 2011
doi:

Summary

在这里,我们描述了一个程序,允许标签<em爱德华ictaluri原位</em在斑点叉尾鮰的组织切片<em>斑点叉尾毛虫</em>作为一个小学,和荧光FITC标记抗体作为辅助用单克隆抗体间接免疫组化Ed9。这允许使用荧光显微镜观察细菌的检测。

Abstract

虽然爱德华ictaluri斑点叉尾毛虫的主要病原体,并已发现了近三十年 1,2,到目前为止,这些作者的知识,没有方法已发展到允许在原位可视化细菌在组织学切片。

虽然细菌的本地化已在以前的研究使用 3,辐射标记 4平板计数,或发光细菌体内确定,这些研究大多只进行总值器官水平,但有一个例外 6 。此限制的特别关注,是因为大肠杆菌ictaluri有一个复杂的感染周期1,7,和它具有的各种致病因素8,9。 E.复杂的相互作用与它的主机ictaluri是在许多方面类似伤寒沙门氏菌10,这是在同一分类家庭。

在这里,我们描述的一种技术,允许检测细菌用间接免疫组织化学,使用单克隆Ed9抗体安斯沃思等11。

简单地说,一个封闭血清应用于石蜡包埋组织切片,以防止非特定招标。然后,部分孵育与初级抗体:E. ictaluri特异性单克隆抗体Ed9。多余的抗体冲洗,加入FITC标记的抗体。冲洗后,部分安装带有荧光的具体安装介质。

这使得对大肠杆菌的检测ictaluri鮰组织的组织切片原位。

Protocol

1。细菌的挑战细菌在一夜之间成长为30 ° C摇脑心浸液肉汤。 停止在鱼缸水的循环和添加肉汤100 1浓度(每升10毫升,例如)。 一小时后孵化,在坦克重新启动的循环水,其余的细菌冲洗出来。 2。采样采样时间和器官取决于研究的目的,但在我们的研究中,我们使用以下采样点:1,6,16,24,36,48,60,72,96,110,125和175小时后感染。…

Discussion

该协议的细节组织切片中的鲶鱼病原体爱德华ictaluri原位可视化技术。据我们所知,这是描述的第一个此类协议。

最关键的一步,在我们的经验,是在作为本议定书不足洗涤步骤4.4中所述的抗体冲洗,可能会导致假阳性。

这项技术的结果与解释的主要问题是组织的自体荧光。然而,人们发现,使用三滤,主要是解决问题的非特异性荧光绝?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者希望认识到,发展援助和进行免疫组化米歇尔巴内斯的技术援助以及佩特里 – 汉森博士,博士鳗鱼和Timothy Brown评论。该项目是由美国农业部(USDA)CRIS项目#MISV – 0801310和密西西比州立大学兽医学院。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Brain Infusion broth Becton Dickinson 237200
MS222 Argent Labs  
Whole mouse Serum Cappel 55989
Goat anti-mouse FitC Southern Biotech 1010-04
Permafluor Lab Vision Ta-030-FM
Potassium chloride (KCl) Sigma P-4504
Triton-X Sigma-Aldrich X100-6X500ML
Bovine Serum Albumin Sigma 85040C
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma P-5379
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma S-5761
Sodium chloride (NaCal) Sigma S-9625
Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) Sigma S-9390

References

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Citer Cet Article
Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples. J. Vis. Exp. (51), e2687, doi:10.3791/2687 (2011).

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