El uso de fluorescentes inmunoquímica para la detección de Edwardsiella ictaluri En el bagre de canal ( I. punctatus) Muestras
Summary
A continuación se describe un procedimiento que permita el etiquetado de los<em> Edwardsiella ictaluri in situ</em> En los cortes histológicos de bagre de canal<em> Ictalurus punctatus</em> Mediante inmunohistoquímica indirecta con anticuerpos monoclonales ED9 como principal, y los anticuerpos fluorescentes FITC etiquetados como secundario. Esto permitió la detección de la bacteria mediante microscopía de fluorescencia.
Abstract
Mientras Edwardsiella ictaluri es un importante patógeno de bagre de canal Ictalurus punctatus y se ha descubierto hace casi tres décadas 1,2, hasta ahora, a lo mejor del conocimiento de estos autores, no existe ningún método ha sido desarrollado para permitir la visualización en situ de la las bacterias en los cortes histológicos.
Mientras que la localización de bacterias se ha determinado in vivo en los estudios previos con el conteo de placas 3, 4 radiométricas etiquetados, o bacterias bioluminiscentes 5, la mayoría de estos estudios se han realizado sólo en el nivel del órgano bruto, con una excepción 6. Esta limitación es particularmente preocupante debido a E. ictaluri tiene un complejo ciclo de infección de 1,7, y tiene una variedad de factores de virulencia 8,9. La compleja interacción de E. ictaluri con su huésped es similar en muchos aspectos a Salmonella typhi 10, que se encuentra en la misma familia taxonómica.
A continuación se describe una técnica que permite la detección de bacterias utilizando indirectos de inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo monoclonal ED9 anticuerpos descritos por Ainsworth et al. 11.
En pocas palabras, un suero de bloqueo se aplica a los cortes histológicos embebidos en parafina para evitar que no específica vinculante. A continuación, las secciones se incuban con el anticuerpo primario: E. ictaluri anticuerpo monoclonal específico ED9. El exceso de anticuerpos se enjuaga y el FITC anticuerpos secundarios marcados se agregan. Después del lavado, las secciones se montan con un fluorescente medio específico de montaje.
Esto permitió la detección de E. ictaluri in situ en secciones histológicas de tejidos bagre de canal.
Protocol
Discussion
Este protocolo detalles de una técnica para la visualización in situ en el bagre patógeno Edwardsiella ictaluri en los cortes histológicos. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer protocolo como se describe.
El paso más crítico, en nuestra experiencia, es el lavado de los anticuerpos como se describe en el paso 4.4 del presente protocolo como el lavado insuficiente puede dar lugar a falsos positivos.
El principal problema con…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer la asistencia técnica de Banes Michelle, así como el Dr. Petrie-Hanson, anguilas y el Dr. Brown Timoteo por su asistencia en el desarrollo y la realización de la inmunohistoquímica. Este proyecto fue financiado por el USDA CRIS proyecto # MISV-0801310 y por la Universidad Estatal de Mississippi Colegio de Medicina Veterinaria.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Brain Infusion broth | Becton Dickinson | 237200 |
| MS222 | Argent Labs | |
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 |
| Goat anti-mouse FitC | Southern Biotech | 1010-04 |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P-4504 |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 85040C |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma | P-5379 |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S-5761 |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma | S-9625 |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma | S-9390 |
References
- Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. . Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. . Fish Pathology. , (2001).
- Lawrence, M. L. . Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. . Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
