Användning av fluorescerande Immuno-kemi för upptäckt av Edwardsiella ictaluri I kanal havskatt ( I. punctatus) Prover
Summary
Här beskriver vi ett förfarande för märkning av<em> Edwardsiella ictaluri på plats</em> I histologiska avsnitt från kanal havskatt<em> Ictalurus punctatus</em> Använda indirekta immunhistokemi med monoklonala antikroppar Ed9 som primär, och fluorescerande märkt FITC-antikroppar som en sekundär. Detta gjorde det möjligt för detektion av bakterien med fluorescerande mikroskopi.
Abstract
Medan Edwardsiella ictaluri är en viktig patogen för kanal havskatt Ictalurus punctatus och har upptäckts nästan tre decennier sedan 1,2 hittills det bästa av dessa författare kunskaper, har ingen metod tagits fram för att möjliggöra in situ-visualisering av bakterier i histologiska avsnitt.
Även bakteriella lokalisering har bestämts in vivo i tidigare studier med platta räknas 3, radiometriska märkt 4, eller självlysande bakterier 5 har de flesta av dessa studier endast utförts på de grova orgel nivå, med ett undantag 6. Denna begränsning är särskilt oroande eftersom E. ictaluri har en komplex infektion cykel 1,7, och den har en mängd olika virulensfaktorer 8,9. Det komplexa samspelet mellan E. ictaluri med sin värd liknar i många avseenden Salmonella typhi 10, vilket är i samma taxonomiska familj.
Här beskriver vi en teknik som möjliggör detektion av bakterier med hjälp av indirekta immunhistokemisk med den monoklonala antikroppen Ed9 beskrivs av Ainsworth et al. 11.
Kortfattat är en blockerande serum tillämpas paraffininbäddad histologiska sektioner för att förhindra icke-specifik bidar. Sedan är de avsnitt inkuberas med den primära antikroppen: E. ictaluri specifik monoklonal antikropp Ed9. Överskott av antikroppar sköljs bort och FITC-märkta sekundära antikroppar tillsätts. Efter sköljning, är de sektioner monterade med ett fluorescerande specifik monteringsmedel.
Detta gjorde det möjligt för detektion av E. ictaluri på plats i histologiska delar av vävnader kanal havskatt.
Protocol
Discussion
Detta protokoll detaljer en teknik för in situ-visualisering av havskatt patogen Edwardsiella ictaluri i histologiska avsnitt. Så vitt vi vet är detta det första protokollet beskrivs.
Det mest kritiska steget i vår erfarenhet, är sköljning av antikroppar som beskrivs i steg 4.4 i detta protokoll som otillräcklig tvättning kan resultera i falskt positiva.
Det största problemet med att tolka resultaten med denna teknik är auto-fluoresce…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tolka tekniskt bistånd från Michelle Banes samt Dr Petrie-Hanson, Dr ålar och Timothy Brown för deras hjälp att utveckla och utföra immunohistokemi. Projektet har finansierats av USDA KRIS-projektet # MISV-0801310 och Mississippi State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Brain Infusion broth | Becton Dickinson | 237200 |
| MS222 | Argent Labs | |
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 |
| Goat anti-mouse FitC | Southern Biotech | 1010-04 |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P-4504 |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 85040C |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma | P-5379 |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S-5761 |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma | S-9625 |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma | S-9390 |
References
- Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. . Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. . Fish Pathology. , (2001).
- Lawrence, M. L. . Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. . Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
