卵巢和输卵管的三维器官培养的海藻酸钙凝胶
Summary
正常细胞在其三维背景的文化代表了一种替代方法研究所需的细胞转化和肿瘤的早期事件。这种方法是用来种植正常的卵巢和输卵管细胞研究在卵巢癌的形成早期事件。
Abstract
卵巢癌是导致妇女因癌症死亡的第五，并已在美国的1 63％的死亡率。卵巢癌的起源的细胞类型仍然是有问题的，可能是卵巢表面上皮（OSE），或输卵管纤毛2,3远端上皮。培养原代培养的正常细胞在体外将帮助科学家模型的具体变化可能导致卵巢癌，在不同的上皮细胞，从而明确地确定起源的细胞类型。这将允许更精确的生物标志物，具有组织特异性基因的变化的动物模型，并针对本病的更好的预防策略的发展。
保持在海藻酸钠水凝胶中的正常细胞，促进细胞的体外培养中短期内其三维的背景下，允许引进的质粒DNA，RNA干扰，小分子。培养机关，从战略的削减使用手术刀，几种文化，从单一的器官可以产生，从单一的动物实验次数增加派生件。这些削减导致扩散的OSE，这是与卵巢癌的形成相关的排卵模型的各个方面。使用此方法可以培养的细胞类型，如OSE中不生长在塑料表面，并促进正常细胞过程中或在癌症形成4的最早事件进行调查。
海藻酸钠水凝胶可用于支持许多类型的组织5增长。海藻酸钠是一种线性多糖的重复单位，对β- D – mannuronic酸和α- L – guluronic酸可与钙离子交联，导致在一个温和的凝胶行动，不破坏组织6,7组成。像其他三维细胞，如基质胶文化矩阵，海藻酸钠为组织提供机械支持;但是，蛋白质不与海藻酸钠矩阵反应，并因此作为一种人工合成的细胞外基质，不会启动细胞信号5的海藻酸钠功能。海藻酸钠水凝胶漂浮在标准细胞培养液中中， 并支持在体外培养的组织生长的体系结构。
一种方法是提交到海藻酸钠水凝胶，可以在长达两个星期的文化保持的卵巢和输卵管器官件的制备，分离，嵌入。器官培养的蛋白质和RNA样品分析细胞酶的释放，也被描述。最后，主要的细胞类型增长是可能的，没有从小鼠遗传永生，并允许使用基因敲除和转基因小鼠的调查。
Protocol
1。卵巢解剖和组织隔离准备的海藻酸钠0.5％（W / V）的解决方案，准备从该协议的修改后的版本，描述以前5，使用无菌PBS和加热到37 ° C。混合倒置或摇晃，但不旋涡。绘制成1 ml注射器，海藻酸钠与25 G针，并保持在37 ° C。 10mm的无菌氯化钙溶液准备组织封装后交联海藻酸钠和温暖至37 ° C。 准备1毫升培养液（αMEM+ 5个单位的青霉素和5微克/ ml链霉素），每口?…
Discussion
利用海藻酸钠水凝胶立体器官培养系统的发展代表了通用的方法，从多种生物体分析许多不同的组织类型。使用三维文化，可以扩展到组织工程和再生医学等领域，因为它提供了一个支架上的细胞能够增长11。目前，我们的实验室正处于初步研究使用人类卵巢和输卵管组织，但是，人类和非人类灵长类动物的毛囊的文化已被描述12,13。
利用海藻酸钠水凝胶的文…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
支持这项工作是由卵巢癌研究基金赠款LT/UIC/01.2011]，UIC的临床和转化科学，UIC的癌症中心，国家卫生部授予C06RR15482研究院的中心。
通过AAALAC认证的规定下批准的动物护理和使用委员会在UIC动物保健协议的准则和法规的规定进行了动物实验。这个项目的动物被安置在伊利诺伊州芝加哥大学的生物资源实验室（BRL）阻隔室。的BRL有一个充分的兽医人员，监控动物每天至少两次，并提供动物保健咨询。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leibovitz L-15 medium | Gibco | 11415 | |
| αMEM medium | Gibco | 12000-022 | |
| Sodium alginate | Novamatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster Carr | 45″ wide roll; 0.0041″ opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | Gibco | |
| ITS solution | Roche | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Labs | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
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Citer Cet Article
King, S. M., Quartuccio, S., Hilliard, T. S., Inoue, K., Burdette, J. E. Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts. J. Vis. Exp. (52), e2804, doi:10.3791/2804 (2011).