CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析
Summary
直接収穫したてのマウスの骨髄、脾臓や胎児の肝臓における分化段階特異的マウス赤血球前駆細胞と前駆体の同定と分子解析のためのフローサイトメトリー法。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119、およびセルサイズに依存しています。
Abstract
赤血球生成の研究は、以前の造血および赤芽球前駆細胞から形成される方法を赤血球を理解することを目指しています。具体的には、赤血球の形成の速度は、その合成組織低酸素によって引き起こされるホルモンのエリスロポエチン（EPO）、によって制御されている。エポの急速な増加に適切な組織の酸素化の結果、赤芽球率の増加を駆動への脅威、赤芽球ストレス応答と呼ばれるプロセス。循環赤血球数の結果の増加は、組織の酸素運搬を改善します。効率的な赤血球産生のストレス反応は、それゆえ生存とそのような高高度、貧血、出血、化学療法または幹細胞移植などの生理学的および病理学的状態からの回復に重要です。
マウスは、赤血球とそのストレス応答の研究のための重要なモデルです。マウス決定的な（成人型）赤血球産生が新生児脾臓で、そして成人の脾臓および骨髄で、胚日12.5と15.5の間に胎児の肝臓で行われます。組織内の赤血球前駆細胞を識別するための古典的な方法は、EPOを含む半固体培地に播種すると、赤色の細胞コロニーを生じさせるために、これらの細胞の能力に依存しています。彼らの赤血球前駆子孫は、形態学的基準に基づいて識別されます。どちらもこれらの古典的な方法のは、分子研究のための分化段階特異的赤血球系細胞の多数へのアクセスを許可しません。ここでは、直接、新たに分離したマウスの組織のコンテキスト内で分化段階特異的赤血球前駆細胞と前駆体を、識別し、勉強のフローサイトメトリー法を提示する。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119上、およびセルサイズの関数であるフローサイトメトリー"前方散乱"パラメータに依存しています。 CD71/Ter119アッセイは低酸素の条件に収容された貧血マウスまたはマウスでは、例えば、in vivoでのエリスロポエチンストレスへの応答中に赤芽球前駆細胞を研究するために使用することができます。また、赤血球内の変更された分子経路の特定の役割を評価するために、遺伝子組み換え成体マウスや胚の組織に直接赤血球前駆細胞を研究するために使用されることがあります。
Protocol
Discussion
フローサイトメトリーの方法論は、リン酸化特異的抗体3と細胞周期の状態を用いて細胞表面マーカー、タンパク質発現、細胞生存、細胞内シグナル伝達を含む、蛍光標識特異的抗体またはリガンド、と検出されても細胞機能の同時調査が可能になります。これらの測定は、新たに単離した赤血球生成組織のコンテキストで、分化段階の特定のサブセットの数の各々に行うことができ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
リチャードKonz、テッドGiehl、バーバラGosselinは、月華区とタミーKrupoch：我々は、ユーマスフローサイトメトリーコアに感謝。この作品は、NIH / NHLBI RO1 HL084168（MS）およびNIH CA T32 – 130807（JRS）によって賄われていた。糖尿病内分泌学研究センター助成金DK32520でサポートされているコアのリソースも使用した。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Fas-biotin | BD Pharmingen | 554256 |
| Streptavidin-APC | Molecular Probes | S868 |
| 40 μm sterile cell strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Falcon | 352008 |
| U-bottom 96 well plate | BD Falcon | 353910 |
| ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 |
| DAPI powder | Roche | 236276 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 |
| FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 |
| APC BrdU Flow kit | BD Pharmingen | 557892 |
| Annexin V-biotin | BD Pharmingen | 556418 |
References
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