Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay
Summary
Eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und molekulare Analyse von Differenzierungs-Stadium-spezifische murine erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt in frisch geernteten Maus Knochenmark, Milz oder fetale Leber. Der Test beruht auf der Zelloberfläche Marker CD71, TER119 und Zellgröße.
Abstract
Das Studium der Erythropoese möchte verstehen, wie rote Blutkörperchen sind aus früheren hämatopoetischen Vorläuferzellen und erythroiden gebildet. Genauer gesagt, ist die Rate der roten Blutkörperchen Bildung durch das Hormon Erythropoietin (Epo), dessen Synthese durch Hypoxie ausgelöst geregelt. Eine Bedrohung für die ausreichende Sauerstoffversorgung des Gewebes führt zu einem raschen Anstieg der Epo, Fahren eine Erhöhung der Erythropoese-Rate, ein Verfahren, wie der erythropoetischen Stress-Reaktion bekannt. Der daraus resultierende Anstieg der Zahl der zirkulierenden roten Blutkörperchen verbessert Gewebe Sauerstoffzufuhr. Eine effiziente erythropoetischen Stress-Reaktion ist daher entscheidend für das Überleben und die Wiederherstellung von physiologischen und pathologischen Bedingungen wie Höhenlage, Anämie, Blutungen, Chemotherapie oder Stammzelltransplantation.
Die Maus ist ein Schlüssel-Modell für das Studium der Erythropoese und ihre Reaktion auf Stress. Maus definitive (Erwachsenen-Typ) Erythropoese findet in der fetalen Leber zwischen embryonalen Tage 12.5 und 15.5, in der Neugeborenen-Milz und in der Erwachsenenbildung Milz und Knochenmark. Klassische Methoden zur Identifizierung erythroiden Vorläuferzellen im Gewebe verlassen sich auf die Fähigkeit dieser Zellen zu steigen, um red cell Kolonien geben, wenn in Epo-haltigen halbfesten ausplattiert. Ihre erythroiden Vorläuferzellen Nachkommen werden auf der Basis morphologischer Kriterien identifiziert. Keiner von diesen klassischen Methoden erlauben den Zugriff auf eine große Anzahl von Differenzierungs-Stadium-spezifischen erythroiden Zellen für die molekulare Untersuchung. Hier präsentieren wir Ihnen eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und Differenzierung Studium-stage-spezifischen erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt im Zusammenhang mit der frisch isolierten Maus Gewebe. Der Test beruht auf der Zell-Oberflächenmarker CD71, TER119, und auf der durchflusszytometrischen 'forward-scatter' Parameter ist das eine Funktion der Größe der Zellen. Die CD71/Ter119 Assay verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen während ihrer Antwort auf erythropoetischen Stress in vivo-Studie werden zum Beispiel bei anämischen Mäusen oder Mäusen in sauerstoffarmen Bedingungen untergebracht. Es kann auch verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen direkt in das Gewebe von genetisch veränderten adulten Mäusen oder Embryonen zu studieren, um die spezifische Rolle der modifizierten molekularen Signalweg in Erythropoese zu beurteilen.
Protocol
Discussion
Die durchflusszytometrische Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung aller zellulären Funktion, die mit einem Fluoreszenz-konjugierte spezifische Antikörper oder Liganden, einschließlich Zelloberflächenmarker, Proteinexpression, das Überleben der Zelle, Zell-Signal mit Hilfe phospho-spezifische Antikörper 3 und Zellzyklus-Status nachgewiesen werden kann. Diese Messungen können in jedem der eine Reihe von Differenzierungs-Bühne spezifische Teilmengen erfolgen, die im Rahmen von frisch isolier…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der UMass Durchflusszytometrie Kern: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu und Tammy Krupoch. Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) und NIH CA T32-130807 (JRS) finanziert. Core-Ressourcen durch die Diabetes Endocrinology Research Center gewähren DK32520 unterstützt wurden ebenfalls verwendet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Fas-biotin | BD Pharmingen | 554256 |
| Streptavidin-APC | Molecular Probes | S868 |
| 40 μm sterile cell strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Falcon | 352008 |
| U-bottom 96 well plate | BD Falcon | 353910 |
| ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 |
| DAPI powder | Roche | 236276 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 |
| FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 |
| APC BrdU Flow kit | BD Pharmingen | 557892 |
| Annexin V-biotin | BD Pharmingen | 556418 |
References
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