Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay
Summary
Un metodo di citometria a flusso per l'identificazione e l'analisi molecolare di cellule progenitrici murino differenziazione fase-specifici eritroide e precursori, direttamente nel midollo del mouse appena raccolte osseo, milza o del fegato fetale. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e le dimensioni delle cellule.
Abstract
Lo studio dell'eritropoiesi si propone di capire come globuli rossi sono formate da progenitori ematopoietici in precedenza e eritroide. In particolare, il tasso di formazione dei globuli rossi è regolata dalla ormone eritropoietina (Epo), la cui sintesi è innescata da ipossia tissutale. Una minaccia a risultati adeguati ossigenazione dei tessuti in un rapido aumento Epo, guidando un aumento della frequenza eritropoietica, un processo noto come la risposta allo stress eritropoietica. Il conseguente aumento del numero dei globuli rossi circolanti aumenta l'ossigeno di consegna dei tessuti. Una risposta efficace dello stress eritropoietica è quindi fondamentale per la sopravvivenza e il recupero da condizioni fisiologiche e patologiche quali l'altitudine elevata, anemia, emorragia, la chemioterapia o il trapianto di cellule staminali.
Il mouse è un modello fondamentale per lo studio della eritropoiesi e la sua risposta allo stress. Eritropoiesi topo definitiva (di tipo adulto) avviene nel fegato fetale tra i giorni embrionale 12,5 e 15,5, nella milza neonatale, e nella milza e nel midollo osseo degli adulti. Metodi classici di identificazione progenitori eritroidi nel tessuto si basano sulla capacità di queste cellule per dare origine a colonie di globuli rossi quando placcato in Epo contenenti semi-solido dei media. Loro progenie precursore eritroidi sono identificate sulla base di criteri morfologici. Nessuno di questi metodi classici consentire l'accesso a un gran numero di differenziazione-stadio-specifiche cellule eritroidi per lo studio molecolare. Qui vi presentiamo un flusso-citometria metodo di identificazione e differenziazione studio-stadio-specifici progenitori eritroidi e precursori, direttamente nel contesto del tessuto del mouse appena isolato. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e sul flusso-citometria a parametro 'avanti dispersione', che è una funzione della dimensione della cella. Il CD71/Ter119 test può essere utilizzato per studiare progenitori eritroidi durante la loro risposta allo stress eritropoietica in vivo, per esempio, nei topi anemici o nei topi tenuti in condizioni di scarsità di ossigeno. Può anche essere usata per studiare progenitori eritroidi direttamente nei tessuti di topi adulti geneticamente modificati o embrioni, al fine di valutare il ruolo specifico del pathway molecolare modificata in eritropoiesi.
Protocol
Discussion
Il flusso-citometria metodologia permette indagine simultanea di tutte le funzioni cellulari che possono essere rilevati con una fluorescenza coniugato anticorpo specifico o ligando, tra cui marcatori di superficie cellulare, espressione di proteine, la sopravvivenza cellulare, segnalazione cellulare utilizzando anticorpi fosfo-specifici 3 e lo stato del ciclo cellulare. Queste misurazioni possono essere effettuate in ciascuna di un certo numero di differenziazione fase sottoinsiemi specifici, nel contesto di…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il UMass nucleo citometria a flusso: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu e Tammy Krupoch. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) e NIH CA T32-130807 (JRS). Risorse di base sostenuto dalla Endocrinologia Diabetes Research Center concedere DK32520 sono stati utilizzati anche.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Fas-biotin | BD Pharmingen | 554256 |
| Streptavidin-APC | Molecular Probes | S868 |
| 40 μm sterile cell strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Falcon | 352008 |
| U-bottom 96 well plate | BD Falcon | 353910 |
| ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 |
| DAPI powder | Roche | 236276 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 |
| FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 |
| APC BrdU Flow kit | BD Pharmingen | 557892 |
| Annexin V-biotin | BD Pharmingen | 556418 |
References
- Liu, Y. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in. 108, 123-133 (2006).
- Socolovsky, M. Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis. PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).
- Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry. J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).
- Socolovsky, M. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98, 3261-3273 (2001).
- Guihard, S. The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis. Blood. 115, 3686-3694 (2010).
- Yu, X. An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis. J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).
- Chen, M. L. Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction. Blood. 114, 4045-4053 (2009).
- Chen, K. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Pop, R. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biol. 8, (2010).
- Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells. Nature. 196, 347-350 (1962).
