Kartläggning och analys av mus erytroida stamceller med CD71/TER119 Flow-cytometrisk analys
Summary
Ett flöde-cytometrisk metod för identifiering och molekylär analys av differentiering-stegs-specifika murin erytroida progenitorer och prekursorer, direkt i nyskördade mus benmärg, mjälte eller lever hos foster. Analysen bygger på cellytan markörer CD71, Ter119 och cellstorlek.
Abstract
Studien av erytropoes syftar till att förstå hur röda blodkroppar bildas från tidigare hematopoetisk och erytroida stamceller. Specifikt är graden av röda blodkroppar bildas regleras av hormonet erytropoietin (EPO), vars syntes utlöses av hypoxi. Ett hot mot tillfredsställande resultat vävnad syresättning i en snabb ökning av Epo, köra en ökning erytropoetiska takt, en process som kallas erytropoetiska stress. Den resulterande ökningen av antalet cirkulerande röda blodkroppar förbättrar leveransen vävnad syre. En effektiv erytropoetisk stress är därför avgörande för överlevnad och återhämtning från fysiologiska och patologiska förhållanden såsom hög höjd, anemi, blödning, kemoterapi eller stamcellstransplantation.
Musen är en viktig modell för studiet av erytropoes och stress. Mus definitiva (vuxen-typ) erytropoes sker i fostrets lever mellan embryonala dagar 12,5 och 15,5, i neonatal mjälten, och hos vuxna mjälte och benmärg. Klassiska metoder för att identifiera erytroida stamceller i vävnad är beroende av förmågan hos dessa celler ger upphov till röda blodkroppar kolonier när pläterade i Epo innehåller halvfast media. Deras erytroida föregångare avkomma identifieras baseras på morfologiska kriterier. Ingen av dessa klassiska metoder ger tillgång till ett stort antal differentiering-stegs-specifika erytroida celler för molekylär studie. Här presenterar vi ett flöde-cytometrisk metod för att identifiera och studera differentiering-stegs-specifika erytroida progenitorer och prekursorer, direkt i samband med nyligen isolerade mus vävnad. Analysen bygger på cellytan markörer CD71, Ter119 och på flöde-cytometrisk "framåt-scatter" parameter, som är en funktion av cellens storlek. Den CD71/Ter119 analysen kan användas för att studera erytroida stamceller under sin reaktion på erytropoietiskt stressen in vivo, till exempel i anemic möss och möss inrymda i låga syreförhållanden. Det kan också användas för att studera erytroida stamceller direkt i vävnaderna av genetiskt modifierade vuxna möss eller embryon, för att bedöma den särskilda roll som den modifierade molekylärnivån i erytropoes.
Protocol
Discussion
Flödet-cytometrisk metoden tillåter samtidig undersökning av cellfunktioner som kan upptäckas med en fluorescens-konjugerad antikropp eller ligand, inklusive markörer cellytan, protein uttryck, cellöverlevnad, cellsignalering med fosfor-specifika antikroppar 3 och cellcykeln status. Dessa mätningar kan göras i varje ett antal differentiering steg specifika undergrupper, i samband med nyligen isolerade erytropoetisk vävnad. Denna metod gör därför bedömningen av funktionella och molekylära förän…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar UMass kärnan flödescytometri: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu och Tammy Krupoch. Detta arbete har finansierats av NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) och NIH CA T32-130.807 (JRS). Kärna resurser som stöds av Diabetes Endokrinologi Research Center bevilja DK32520 användes också.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Fas-biotin | BD Pharmingen | 554256 |
| Streptavidin-APC | Molecular Probes | S868 |
| 40 μm sterile cell strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Falcon | 352008 |
| U-bottom 96 well plate | BD Falcon | 353910 |
| ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 |
| DAPI powder | Roche | 236276 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 |
| FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 |
| APC BrdU Flow kit | BD Pharmingen | 557892 |
| Annexin V-biotin | BD Pharmingen | 556418 |
References
- Liu, Y. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in. 108, 123-133 (2006).
- Socolovsky, M. Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis. PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).
- Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry. J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).
- Socolovsky, M. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98, 3261-3273 (2001).
- Guihard, S. The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis. Blood. 115, 3686-3694 (2010).
- Yu, X. An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis. J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).
- Chen, M. L. Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction. Blood. 114, 4045-4053 (2009).
- Chen, K. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Pop, R. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biol. 8, (2010).
- Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells. Nature. 196, 347-350 (1962).
