CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz
Summary
Doğrudan taze hasat fare kemik iliği, dalak veya fetal karaciğer farklılaşma aşamalı özel fare eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve moleküler analiz için bir akış sitometri yöntemi. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 ve hücre boyutu dayanır.
Abstract
Eritropoez çalışmada, kırmızı kan hücrelerinin erken hematopoetik ve eritroid atalarıdır nasıl şekillendiğini anlamak hedefliyor. Özellikle kırmızı hücre oluşumu oranı sentezi, doku hipoksisi tarafından tetiklenir eritropoietin hormonu (EPO), tarafından düzenlenir. Epo hızlı bir artış yeterli oksijenlenme sonuçları, eritropoetik oranı artış sürüş için bir tehdit, eritropoetik stres yanıtı olarak bilinen bir süreçtir. Dolaşımdaki kırmızı hücrelerin sayısında artış dokuya oksijen taşınmasını artırır. Bu nedenle, verimli bir eritropoetik stres yanıtı yüksek irtifa, anemi, kanama, kemoterapi ya da kök hücre nakli gibi fizyolojik ve patolojik koşullarda hayatta kalma ve kurtarma için kritik öneme sahiptir.
Fare eritropoezi çalışma ve stres yanıtı için önemli bir model. Fare kesin (erişkin tip) eritropoezi yenidoğan dalak, ve yetişkin dalak ve kemik iliği, fetal karaciğer embriyonik gün 12,5 ve 15,5 arasında yer alır. Dokusunda eritroid atalarıdır Klasik yöntemler, kırmızı hücre kolonileri Epo içeren yarı-katı medya kaplama yol vermek için bu hücrelerin yeteneği güveniyor. Onların eritroid prekürsör döl morfolojik kriterlere göre tespit edilir. Ne bu klasik yöntemlerle moleküler çalışma için farklılaşma aşamalı özel eritroid hücreler çok sayıda erişim sağlar. Burada doğrudan taze izole fare doku bağlamında farklılaşma aşamalı özel eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve eğitimi bir akış sitometri yöntemi mevcut. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 dayanmaktadır ve akış sitometrik 'ileriye dağılım' parametre, hangi hücre büyüklüğünün bir fonksiyonudur. CD71/Ter119 testi in vivo eritropoetik strese tepki sırasında eritroid atalarıdır çalışma için kullanılabilir, örneğin, anemik fare ya da fare düşük oksijen koşullarında ev sahipliği yapmaktadır. Ayrıca eritropoezi değiştirilmiş moleküler yolun belirli bir rolü değerlendirmek üzere, eritroid, genetik olarak değiştirilmiş yetişkin fareler ya da embriyoların dokularda doğrudan atalarıdır çalışma olabilir.
Protocol
Discussion
Akış sitometri yöntemi, hücre yüzey belirteçleri, protein ekspresyonu, hücre sağkalım, fosfor-spesifik antikorların 3 ve hücre döngüsü durumu kullanarak hücre sinyalizasyon dahil olmak üzere bir floresan konjuge spesifik antikor veya ligand, ile tespit edilebilir herhangi bir hücresel fonksiyonları eş zamanlı olarak soruşturma sağlar. Bu ölçümler, taze izole eritropoetik doku bağlamında, farklılaşma aşamasında belirli alt kümelerini bir dizi her yapılabilir. Bu yöntem, bu ned…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz UMass flow sitometri çekirdek teşekkür ederim: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu ve Tammy Krupoch. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü / NHLBI RO1 HL084168 (MS) ve NIH CA T32-130.807 (JRS) tarafından finanse edildi. Diyabet Endokrinoloji Araştırma Merkezi hibe DK32520 tarafından desteklenen temel kaynakları da kullanılmıştır.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Fas-biotin | BD Pharmingen | 554256 |
| Streptavidin-APC | Molecular Probes | S868 |
| 40 μm sterile cell strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Falcon | 352008 |
| U-bottom 96 well plate | BD Falcon | 353910 |
| ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 |
| DAPI powder | Roche | 236276 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 |
| FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 |
| APC BrdU Flow kit | BD Pharmingen | 557892 |
| Annexin V-biotin | BD Pharmingen | 556418 |
References
- Liu, Y. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in. 108, 123-133 (2006).
- Socolovsky, M. Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis. PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).
- Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry. J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).
- Socolovsky, M. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98, 3261-3273 (2001).
- Guihard, S. The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis. Blood. 115, 3686-3694 (2010).
- Yu, X. An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis. J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).
- Chen, M. L. Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction. Blood. 114, 4045-4053 (2009).
- Chen, K. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Pop, R. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biol. 8, (2010).
- Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells. Nature. 196, 347-350 (1962).
